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一种新型慢病毒载体制备体系的初步建立 一种新型慢病毒载体制备体系 的初步建立 硕士研究生：马强 指导老师：李明 摘要 目的：以人类免疫缺陷病毒(HIv—1)为基础构建的慢病毒载体具有感染 低分裂潜能细胞、整合目的基因至靶细胞基因组并可以长期稳定表达、免疫反 应轻微等优点，在临床医学和基础医学领域中有广泛的应用前景。 本系统采用“三质粒+重组痘苗病毒”的方式生产慢病毒载体，期望获得高拷 贝数、安全型的适合临床应用的慢病毒载体。 方法：本系统主要生产方法为构建主框架质粒pVECKNA、包装质粒 pGAGPOL,7及包膜质粒pVSVG。通过脂质体将这三个质粒共转染至BHK2t细胞， 再用含有T7RNA聚合酶基因的重组痘苗病毒vTF-3感染细胞，在生产细胞中，痘 苗病毒转录翻译系统指导T7RNA聚合酶的转录和翻译，然后T7RNA聚合酶指导慢 病毒载体cDNA的转录，痘苗病毒RNA聚合酶指导包装蛋1；Ip24等以及包膜蛋白 水泡性口炎病毒包膜蛋白(VSV-G)的转录翻译，最后由VSV-G包装慢病毒载体 RNA以及功能蛋白形成慢病毒颗粒，经细胞分泌释放到培养上清中，收集培养上 清经o．22}_tm滤膜过滤得到慢病毒载体。 结果：RT-PCR及测序比对结果提示培养上清中含有慢病毒载体的基因组 RNA。当三质粒与辅助痘苗病毒共转染生产细胞BHK2l，48h后，共聚焦显微镜下 观察到生产细胞表达p24蛋白，并且其主要分布于胞质中，而在细胞核中基本不 表达，这提示质粒pGAGPOL构建成功：普通倒置荧光显微镜下观察到生产细胞 表达GFP，提示质粒pVECRNA构建成功，以上结果也提示生产系统正常工作。 硕士研究生论文 将培养上清感染BHK2l细胞和293T细胞，48h后，倒置荧光显微镜下观察至IJBHK2I 细胞和293T细胞均表达GFP，这提示利用本系统制备慢病毒载体颗粒的可行性。 为了提高系统产量，本研究对培养慢病毒载体所用的细胞系、质粒用量、重 组痘苗病毒和细胞数比例(MOI)三个对慢病毒载体生产起关键作用的条件进行 优化。每个因素取三个作用水平。所有结果在SPSSl3，0软件中整理，按照3*3*3 析因方差分析方法分析实验数据(计量资料用x如表示，尸0，05表示差异有显 著性意义)。 实验结果表明细胞系、质粒用量以及MOI对载体产量有交互作用(F=7，728， P0．001)。 不同种生产细胞株之间慢病毒载体的产量有显著的统计学差异(F= (416．4l±186．99)×108c／ml。 不同的MOI对病毒载体产量有显著统计学差异(F=311．543、PO．001)。其 中病毒载体拷贝数在MOI为1时病毒载体拷贝数最高。 不同的质粒用量对病毒载体产量有显著性统计学差异(F=137．268、 P0．001)，病毒载体拷贝数在质粒用量为lOp．g条件下最高。 通过不同细胞株产量之间的比较，发现以BHK2，为生产细胞时的系统产量远 大于以HepG2和Vero细胞为生产细胞时的系统产量。因此以BHK2l为生产细胞， 对质粒用量和MOI进行3*3析因分析(计量资料用x虹表示，P0．05表示差异 有显著性意义)。 通过结果可以得知：不同的质粒用量和MOI存在交互作用(F=9．980、 P0．001)。 不同的质粒用量对病毒载体产量有显著性差异(F=92．997、PO．001)。其中 病毒载体拷贝数在质粒用量为lOng时病毒载体拷贝数最高。采用Tamhane法(方 差不齐)进行两两比较，发现质粒用量为5Bg时的系统产量与质粒用量为10#g TT 一种新型慢病毒载体制备体系的初步建立 时的系统产量与质粒用量为15嵋(P=0．987)时系统产量无显著性差异。 拷贝数MOI为l条件下产量最高。采用Tamhane法(方差不齐)进行两两比较， 得到MOI为0．1和1时，系统产量没有显著性差异(P=O．801)，MOI为5时， 最后得出BHK2l为生产细胞，37C，5％C02培养条件下，质粒用量为 pVECRNA (11707．67士802．263)×10sc／ml。