一株新的鼠抗人d40单克隆抗体的制备及其应用.pdf

…株新的鼠抗人CD40单克隆抗体的制备及其应用 摘要 一株新的鼠抗人CD40单克隆抗体的制备及其应用 摘要 家族成员。CD40广泛表达于许多类型细胞表面，包括不同发育和分化阶段的B淋巴 细胞、单核细胞、树突状细胞、造血前体细胞和内皮细胞以及一系列肿瘤细胞等。 CD40是免疫应答中关键性的共信号分子，其与配体(CD40L)的相互作用提供T、 B细胞活化所必需的第二信号。CD40分子可介导B细胞的增殖、分化、抗体的分泌 和类型转换；树突状细胞的激发、分化和成熟；T淋巴细胞的活化及细胞免疫功能的 调节：内皮细胞粘附分子的改变。炎症因子的释放，白细胞在炎症部位的聚集等。 近年研究表明，多种疾病的发生发展均与CD40分子相关，如自身免疫性疾病、 传染性疾病、移植排斥、肿瘤及动脉粥样硬化等。运用阻断型CD40L抗体在动物模 型上可以显著延长移植器官的生存，但仍然存在副作用和安全性的问题，而直接阻 断CD40分子的治疗策略有望能改善其缺点。最近发现CD40分子除了膜型的形式还 这种可溶性形式的CD40分子在肾脏和肝脏疾病患者的血清中的浓度远高于正常人， 和这些疾病的发生、发展有密切的相关性。目前关于CD40阻断型抗体和sCD40方 面的报道甚少，基于我室已经成功研制了激发型CD40单克隆抗体，研制识别位点 不同、功能不同的阻断型CD40单抗以及sCIM0ELISA试剂盒将在肿瘤、移植排斥 反应和自身免疫性疾病中具有重要的理论研究和临床应用价值。 本研究以高表达CD40分子的XG2细胞株为抗原，应用SP2／0作为亲本骨髓瘤 细胞，采用细胞融合、单克隆抗体筛选、荧光标记、免疫印迹和竞争抑制等方法获 得并建立了一株持续分泌特异性鼠抗人CD40单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株， 命名为3G3。经体外长期传代培养、液氮冻存半年以上复苏良好，分泌抗体的性能 稳定。 杂交瘤细胞经体外扩大培养，诱导同种小鼠产生的腹水型单抗，经Protein G纯 I 株新的鼠抗人CD40单克隆抗体的制备及其应用 摘要 化获得纯抗体蛋白，经表型分析、Westernblotting鉴定和竞争抑制试验，证实3G3 是识别人CD40分子的特异性单抗；经快速试纸鉴定属小鼠IgG2a亚类。流式细胞 MM细胞株XG7。 以XG2为竞争靶细胞，经间接免疫荧光标记的竞争抑制试验，结果显示，3G3 学功能的研究结果表明：3G3在混合淋巴细胞反应中能抑制淋巴细胞的增殖，并且 抑制激发型CD40单抗诱导的Daudi细胞的同型聚集，为阻断型单抗。它在器官移植 的排斥反应和自身免疫性疾病等的防治中可能具有潜在的应用价值。 基于3G3和5C11的识别位点完全不同，研制了稳定、特异和高灵敏性可溶性 皿血清或体液中sCD40的水平进行分析结果显示甲亢、慢性肾炎、白血病、类矾湿 关节炎患者的血清、肺癌患者血清和胸水中sCD40明显高于正常对照者。我们初步 的研究证实，sCD40的定量分析，对某些自身免疫性疾病及恶性肿瘤可能具有重要 的研究和临床意义。 综上所述，本研究成功研制一株识别位点不同的鼠抗人CD40阻断型单克隆抗 联检测试剂盒。用该试剂盒对一些CD40信号异常的疾病患者外周血检测，发现多 种疾病血清或体液中sCD40明显高于正常人，表明在临床检测中具有潜在的应用价 值。 (ELISA) 硕士研究生：庄羽美 导 师：张学光教授 II ～壁堑堕垦丛垒!里竺兰塞些垫竺墼型墨墨苎竺里———————————!!墨 Monoclonal ANovelAnti—human of