人canstain基因稳定转染cho-k1细胞及其表达产物的生物学作用研究.pdfVIP

人canstatin 基因稳定转染CHO-K1 细胞 及其表达产物的生物学作用研究 研 究 生：胡 丽 导师：朱建思 教授 中 文 摘 要 [ 目的] 将人canstatin cDNA 分泌型真核表达载体pSecTag2B/canstatin 稳 定转染中国仓鼠卵巢（CHO-K1）细胞并获得稳定表达canstatin 蛋白产物的细胞 株。再用含 canstatin 的上清液作用人脐静脉内皮细胞 （HUVEC-12）以进一步 研究canstatin 的生物学作用。 [方法] 将人canstatin cDNA 的重组质粒pSecTag2B/canstatin 稳定转染中国仓 鼠卵巢（CHO-K1 ）细胞并获得稳定表达 canstatin 蛋白产物的细胞株，应用 RT-PCR 检测细胞中 canstatin 基因的表达。收集细胞培养上清液中的蛋白，采用 western-blotting 法鉴定表达产物，用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM ）实验初步鉴定其生 物学活性。通过绘制细胞生长曲线和流式细胞学技术进一步研究canstatin 对血 管内皮细胞的生物学作用。 [结果] 成功的将人canstatin cDNA 的重组质粒pSecTag2B/canstatin 稳定转 染 CHO-K1 细胞，RT-PCR 法证实质粒 pSecTag2B/canstatin 已成功转染进入 CHO-K1 细胞。离心收集细胞培养上清液，western-blotting 法鉴定上清液中有目 的蛋白的表达。该细胞培养上清液在体内能抑制鸡胚绒毛尿囊膜中微血管的生 成，可见CHO-K1/pSecTag2B/canstatin 组给药区及其周围血管明显减少甚至未见 血管纹理，小血管分支少，而其余四组鸡胚尿囊膜血管生成没有明显影响。通过 鸡胚处理前后血管生成记数，CHO-K1/pSecTag2B/canstatin 组与其余四组之间经 统计学处理差异有显著性(P ＜0.05) 。通过绘制细胞生长曲线显示 1 CHO-K1/pSecTag2B/canstatin 细胞培养上清液可在体外抑制HUVEC-12 的生长， 而对照组对内皮细胞生长无明显抑制。流式细胞学技术检测显示其可以在体外诱 导HUVEC-12 凋亡。 [结论] 1、成功的将人canstatin cDNA 分泌型真核表达载体pSecTag2B/canstatin 稳定 转染中国仓鼠卵巢（CHO-K1）细胞并获得能稳定表达canstatin 蛋白产物的细胞 株。 2、证实含 canstatin 蛋白产物的细胞培养上清液具有抑制鸡胚绒毛尿囊膜微血 管生成的活性。 3、证实含canstatin 蛋白产物的细胞培养上清液可在体外抑制人脐静脉内皮细 胞 （HUVEC-12）的生长，并诱导HUVEC-12 凋亡。 [关键词] 稳定转染；脂质体；鸡胚绒毛尿囊膜实验 ，生长曲线，流式细胞 学技术 2 Transfecting human canstatin gene secretory eukaryotic expression vector into CHO-K1 cells stably and identifing biological activity of the supernatant ABSTRACT [Objectives] Stably transfecting the Secretory eukaryotic expression vector of human canstatin gene into CHO-K1 cells to get the cell strain that can express the canstatin proteins stably. Centrifuging and collecting the