人类dna损伤复基因hr24l的克隆和功能研究.pdf

人类DNA损伤修复基因hR24L的克隆与功能研究 中文摘 要 目的：克隆人类DNA损伤修复基因hR24L，构建其正义 和反义表达载体重组体，为该基因的结构和功能研究奠定实验 基础；用外源性hR24L基因转染哺乳动物细胞，得到稳定遗传 的细胞系。观察转染细胞增殖速度的变化，检测细胞周期，了 解外源性hR24L基因转染对哺乳动物细胞周期的影响，研究其 作用机制；观察正义和反义hR24L基因转染对细胞凋亡的影 响，了解修复基因与细胞凋亡的关系，为肿瘤的基因诊断和基 因治疗(特别是反义核酸)的研究积累资料；研究电离辐射对 哺乳动物细胞内源性hR24L表达的影响，了解其作用特点。 方法： 首先用PCR方法扩增hR24L的开放阅读框(0RF)， 克隆入pGEM—T载体，经酶切鉴定和测序无突变后，重组到逆转 录病毒表达载体(pDor—neo)中，得到正义和反义重组体 别转染MCF7细胞，筛选出阳性克隆，得到稳定遗传的细胞系， 并用Southern印迹杂交证实外源性hR24L已成功整合到细胞基 因组中。观察细胞生长速度，与空载体转染细胞相比较。用 细胞仪检测细胞周期变化情况。接着用过氧化氢、丁酸钠和去 血清饥饿等方法分别诱导不同质粒转染的MCF7细胞发生凋亡， 用流式细胞仪和电泳检测细胞凋亡情况。同时用RT-PCR方法 无突变后用Y射线照射细胞，用No,hem印迹杂交分析hR24L 表达变化。 结果：正义hR24L转染细胞生长较慢，而反义hR24L转 染细胞生长较快。进一步Northern印迹杂交发现，转入正义 降低其表达，说明hR24L基因的表达抑制了细胞生长。流式细 胞仪检测细胞周期表明，转染后6小时正义转染细胞G。+M期的 比例(18％)明显高于其它三种细胞(6％)，说明hR24L蛋白升 高时可以使细胞周期阻滞在G。／M期，hR24L蛋白参与了细胞周 期调控。诱导凋亡后发现，正义转染细胞的hR24LmRNA表达升 明显降低；反义转染细胞的hR24LmRNA表达则下降，但其凋亡 表明正义和反义hR24L均抑制过氧化氢和去血清饥饿诱导的凋 亡，但它们对丁酸钠诱导的凋亡均无抑制作用。通过MCF7细胞 录在1h后开始上升，2h后达高峰，3h后恢复正常。 结论：hR24L基因的表达可以抑制细胞增殖，其机制是引 起细胞周期阻滞，参与细胞周期调控；正、反义hR24L基因都能 抑制细胞凋亡，其作用机制可能通过影响复杂的信号传递途径； hP,24L基因的表达具有损伤诱导性，其表达产物对Y射线诱导的 损伤有修复作用。 关键词：DNA损伤；修复基因；hR24L基因；基因克 细胞转染； 细胞凋亡； 周期阻滞；电离辐 隆；MCF7细胞； 射 ．d． 英 文 摘 要 The ofthehumanDNA hR24L cloning repairgene andthe onitsfunction study The ofthis isto thefunction subject study explore DNA this ofhumanrepairgene．In procedure，theopen ified and hR24Lwas PCR was frame(ORF)of reading ampl by the vector clonedinto retroviral pDor-neo