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人血管内皮生长因子在CHO细胞中的高效表达 硕士研究生： 张遇山 指导教师： 施广霞教授 指导小组： 杨治华教授 专业名称： 病理学和病理生理学 摘 要 血管生成与肿瘤和血管异常疾病等许多重要疾病的发生发展密切 相关，以调控血管生成为手段的治疗策略可能会成为预防和治疗相关 endothelial 疾病的有效的新方法。血管内皮生长因子(Vascular growth factor，VEGF)是最重要的血管生成促进因子，有六种异构体，其中 又以含165个氨基酸残基的异构体VEGFl6J为体内主要活性形式。动 物实验研究表明，VEGFl65可明显改善缺血组织的血供，可能在临床治 疗相关疾病中有潜在的应用价值。为此：本研究克隆并在真核细胞中 hamster 国仓鼠卵巢(Chineseovary,CHO)细胞中表达了人VEGFl65， 并对影响表达的调控元件及其它因素进行了研究。 ，一 I本研究首先采用RT-PCR的方法从胎儿肝脏组织中克隆了带有自 身信号肽序列的人VEGFl65基因，经核苷酸序列测定鉴定其氨基酸序 列正确后，将此带有自身信号肽序列的VEGFl65基因克隆入真核高效 表达载体pSKDC中，构建成功VEGFI∞真核重组表达载体。采用脂质 体转染的方法将构建的重组表达载体导入二氢叶酸还原酶缺陷型CHO 氨甲喋呤(MTx)进一步施加选择压力扩增表达，目前表达产量己扩 增了18倍以上，成功地获得了高表达人VEGFl65的工程细胞。采用夹 J65的生物学活性，结果 刺激内皮细胞增殖的方法测定所表达的VEGF 表明所表达的VEGFm可显著地刺激内皮细胞的增殖，并呈现相应的 剂量依赖关系，在VEGFl65浓度为5ng／ml时，其刺激增殖的效率可达 66％。本研究同时还采用在大肠杆菌中表达的VEGFl65做对照研究，结 在CHO细胞中表达的VEGFl6s就可刺激增殖12．3％，且再增加原核表 达的VEGFl“的浓度也不能加强对其对内皮细胞增殖的刺激作用。两 者活性相差约21倍。这些结果表明本研究在CHO细胞中成功地表达 了高活性的VEGFl65，其活性远高于在原核细胞中表达的VEGFl6s，提 示只有真核细胞才能表达出高活性的人VEGFt65蛋白。本研究还采用 抗VEGF多抗中和VEGFl6s刺激内皮细胞增殖的生物活性，结果所表 达的VEGF刺激内皮细胞增殖的活性可被抗VEGF多抗几乎完全中和， 进一步确证了所表达的蛋白确实具有刺激内皮细胞增殖活性的VEGF。 为了研究影响目的基因表达的各种元件及因素，进一步提高 VEGFl6s在CHO细胞中的表达产量，以便为今后应用VEGF治疗相关 疾病的研究打下更坚实的基础，本研究同时对翻译型增强子、转染时 DNA的量、dhfr+neo双表型阳性筛选、其它类信号肽对获得高产量细 胞株的影响进行了研究。本研究以内皮抑素(Endostatin)为指示目标 蛋白，开展了对翻译型增强子、转染时DNA的量影响表达的研究。首 先构建了含有或不含翻译型增强子SPl63的Endostatin的两种重组真 核表达载体，并导入dhfr．CHO细胞进行表达，结果显示翻译型增强子 能增加目的蛋白的表达，可提高表达产量约2倍。此外，在含有Endostatin 的同一表达载体转染CHO时，采用不同的DNA的量进行转染，ELISA 测定产量的结果提示，DNA量高的组的产量优于DNA量低的组，提 示可能在一定的范围内，采用较多的DNA进行转染可提高阳性克隆的 2 表达水平。本研究还比较了dhfr单表型阳性的克隆与dhfr+neo双表型 阳性的克隆表达产量之间的差别，结果表明双表型阳性的克隆表达产 量显著高于单表型阳性的克隆，两者可相差2．7倍，提示双表型阳性筛 选方法优于单表型阳性筛选。S12是一含12个氨基酸残基的抗体信号 肽，已被证明在抗体表达中表达产量优于其它信号肽，因此，本研究 采用重组PCR的方法，将VEGFl65的自身的信号肽替换为s12，并在 和VEGFl65基因的重组表达载体，导入CHO细