小鼠白细胞介素2cdna克隆、单链融合基因的构建及其真核表达、检测和初步应用.pdf

中 文 摘 要 小鼠白细胞介素12cDNA克隆、单链融合基因的 构建及其真核表达、检测和初步应用 摘 要 目的:克隆小鼠白细胞介素12(IL-12)的p40亚单 位的cDNA和p35亚单位的cDNA，构建小鼠IL-12单链融 合基因及其真核表达质粒，使其在真核细胞表达，初步探 索其体内对小鼠肝癌基因治疗的效果。 方法:从经LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞提取总RNA, 用RT-PCR法，分别获得编码小鼠IL-12p40和p35业单位 序列的p40cDNA和p35cDNA:通过二次PCR扩增，分别在 p40cDNA的下游、p35cDNA的上游引入一个编码疏水性弹 性蛋白多肤接头 (Cly,Ser)。的一段DNA序列，并在该接 头序列中、p40cDNA的上游、p35cDNA的下游引入酶切位 点。然后通过基因重组，将带有接头序列和酶切位点的 p40,p35两亚基cDNA依次克隆入pcDNA:，真核表达质粒， 构建成 工L-12单链融合基 因的真核表达质粒 pcDNA,:-IL-12。pcDNA,:-IL-12经 PEG纯化’后，用 DEAE-dextran法，以5lag质粒/1X10细胞，转染COS-7 细胞。被转染的COS-7细胞，370C,5%CO,，饱和湿度下培 养40小时。取上清作为转染上清，用ELISA法检测转染上 清中工L-12的蛋白含量。于正常小鼠背部皮内两点注射 PEG纯化的pcDNA厂:IL-12(50ug/501AHEbuffer/只)4 天后，MTT法检测该小鼠脾细胞的NK活性;观察同样皮内 中 文 摘 要 注射同剂量纯化的pcDNA,:-IL-12对荷H22腹水型肝癌细胞 瘤小鼠生存期的影响。 结果:使用Taq酶所克隆的IL-12p40cDNA和p35cDNA 序列长度与预期一致，但其编码的氨基酸有6个发生了改 变，氨基酸正确率99%。后以同一反转录产物为摸板，改 用高保真酶 (Pyrobest酶)经两次 PCR扩增，所得 IL-12p35cDNA序列与文献报道完全一致 (Genebank登录 号M86672),所得1L-12p40cDNA序列中第1000个碱基， 两次扩增的测序结果都是G，与Genebank登录号AH004859 的报道一致，虽Genebank登录号M86671报道为A，但所 编码氨基酸相同，都是丝氨酸。成功构建了小鼠IL-12单 链融合基因的真核表达质粒pcDNA,:一工L-12。该质粒转染的 COS-7细胞的培养上清经ELISA法检测，工L-12的蛋白含 量达2-3ng/ml。皮内注射pcDNAn一IL-12，使正常小鼠脾细 胞的NK活性明显增强 (P0.01)，使荷H2:肝癌细胞瘤小 鼠的生存期延长 (P0.05). 结论:成功克隆了序列完全正确的IL-12p40cDNA和 p35cDNA两基因片一段，构建了小鼠IL-12单链融合基因和 它的真核表达质粒，可在真核细胞表达生物学活性工L-12, 可用于肿瘤基因治疗研究。 关键词:白细胞介素一12，基因克隆，融合基因，真 核表达，基因治疗，小鼠 英 文 摘 要 cDNA Cloning,SingleChain Fusion Gene Construction,EukaryoticExpression,Detection andPrimaryApplicationofMouseIL-12 ABSTRACT Objective:To clone the cDNAsofmouse interleukin-12(IL-12)p40-andp35-subunit,toconstructa singlechainfusiongene of mouseIL-12andits eukaryoticexpressionplasmidinordertoexpressin eukaryoticcellsandpreliminarilytoexploreitsefficiency ingenetherapyformousehepatomainvivo. Methods:ThetotalRNAwasextractedfrom mouse