锁式探针滚环扩方法在小鼠f9单细胞基因表达研究中的应用.pdfVIP

北京协和医学院硕I：研究生论文 中文摘要 基因表达检测与分析是研究细胞功能的重要手段之一，但传统的分析方法通常是 以细胞群体为研究对象，·得到的是细胞群体mRNA的整体或平均表达水平，缺少针 对单细胞中mRNA定位和定量分析的有效手段。锁式探针滚环扩增(Padlock 靶点的特异性结合，连接转换为环形分子后滚环扩增原位检测单链DNA靶点。该技 术具有高特异性和高敏感性，能定位和定量分析单细胞内DNA靶点，因此与PCR 和传统原位杂交技术相比有明显优势。Padlock．IⅪA是一系列反应的整合，首先，利 用特异的锁核酸(Locked舢cleicacid，LNA)与mIⅢA结合，可在细胞内原位将mI斟A 反转录成cDNA，通过RN鹋e H将mRNA降解的同时，锁式探针(Padlockprobe)与新 合成的cDNA中靶序列结合，并通过连接酶的作用，锁式探针自连环化，形成单链环 化模板。随后在Phi29聚合酶的作用下，对环化产物进行滚环扩增(RCA)，最后荧 光探针与扩增产物上的靶序列特异性结合，从而实现对细胞内111]fⅢA的表达水平的 检测。Padlock．RCA对组织细胞中含量极低的mRNA有极高