实验四姊妹染色单体分染技术(学时)(综合性设计性精要.pptVIP

人体淋巴细胞姐妹染色单体互换 * 实验四、姊妹染色单体分染技术（３学时）（综合性、设计性实验） 一、实验目的和要求 了解姊妹染色单体差别染色技术的原理和制作ＳＣＥ标本的方法，并通过ＳＣＥ标本的观察，掌握ＳＣＥ计数方法。 二、实验原理 在ＤＮＡ复制过程中，核苷的类似物５－溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）能代替胸腺嘧啶进入到新合成的ＤＮＡ链中，植物根尖在含有适当Brdu的培养液中生长二个分裂周期后，中期染色体的两条染色单体在化学组成上有了差别，一条染色单体的两条ＤＮＡ链均为新合成的，因此Ｔ位完全由Brdu代替，另一条染色单体的一条ＤＮＡ链是新合成的，所以只有一条ＤＮＡ中含有Brdu，这样的细胞经染色后，一条为深染，一条为淡染，所以称之为姊妹染色单体的差别染色。本实验运用这一原理，利用大蒜根尖作为材料，经过适当处理制片，可观察到姊妹染色单体分染现象。 姊妹染色单体区分染色法中使用的诱变剂是什么？原理是什么？5-Brdu。旺盛分裂的组织细胞，由于细胞分裂旺盛，DNA的合成量大，会出现核苷酸短缺的情况，5-Brdu与碱基中的尿嘧啶结构相似，会掺入到DNA合成链中与腺嘌呤配对，而在后续的合成中，5-Brdu会和5-Brdu结合形成紧密结合。当用HCl解离DNA时，会有醛基暴露出来，而使用改良的席夫试剂中含有的无色SO2会和醛基结合形成紫色基团。但是掺入了5-Brdu的DNA链不易被解离，所以不易形成紫色基团。在显微镜下就可见染色深浅不一的姊妹染色单体 孚尔根染色法是鉴别细胞中DNA反应的组织化学方法。细胞内的DNA(通常位于核及染色体上)在1N HCl 60℃水解时部分地破坏了脱氧核糖与嘌呤碱之间的糖苷键而使嘌呤碱脱掉，从而使脱氧核糖的第一个碳原子上潜在的醛基获得了自由状态。而无色的亚硫酸品红是由偏重亚硫酸钠、盐酸和碱性品红配制成的。偏重亚硫酸钠与盐酸能产生亚硫酸根，当具有醌式结构的碱性品红分子与亚硫酸根结合后，醌式结构的共轭双键被打开，碱性品红变为无色。当用这种无色的亚硫酸品红去染经酸解的细胞时，就会与染色体DNA上游离的醛基结合，又出现了呈现红色的醌式结构，从而使DNA分子着色。这一反应是1924年由Feulgen 和Rossonbek 所发现和确定的，已广泛用作鉴别DNA的一种特异性检查方法。 优点：制片清洁，染色体清晰，组织软化好，易于压片，还可以对染色体DNA的含量进行测定。 缺点：染色体较软，容易缠绕，不易分散，在加强前处理使染色体缩短的情况下，可获得较好的效果。另外，对小型染色体的材料效果较差。这一方法在切片、涂片上研究核及染色体时能减少细胞质着色对观察的影响。因此在细胞学研究中受到了普遍的重视。 水解是本实验成败的关键之一。温度应保持在60?0.5℃之间(用两支温度计相互校正)。如果温度过低或时间过短，酸解不够，醛基暴露不充分，染色会过浅；若温度过高或时间过长，会造成酸解过度，使DNA完全解聚，糖与醛基之间的键被破坏，游离的核酸分子会扩散到细胞质中，从而造成染色浅或不均一的现象。 水解的时间很重要，因为核酸的水解有两个过程。第一，嘌呤碱很快被除掉，脱氧核糖中潜在的醛基显露出来。第二，组蛋白和核酸越来越多地被除掉。在短时间的水解作用以后，第一个过程占优势，这时候用Schiff试剂染色，染色体的染色作用最强。随水解作用的继续进行，第二个过程逐渐变成优势，因此水解液中的Schiff反应增强，而染色体中的Schiff反应减弱。最后，第二个过程超过第一个过程时，染色体也随之停止反应。 RNA分子中也有嘌呤碱，那么经酸解后，用Schiff试剂染色时，为什么不能使RNA分子着色呢？这是由于在酸解的情况下，RNA分子较DNA分子稳定，它的醛基难以游离出来。所以，利用孚尔根法染色时，只能使DNA分子着色而不能使RNA分子着色。 影响孚尔根反应的主要因素有以下几个方面： (1)水解时间和温度： 这是实验的主要关键。水解适当时，染色体着色较深而细胞质不显颜色，水解不足，染色体着色浅淡，细胞质中可能有其他醛基存在而显示扩散的红色。水解过度，则染色体着色不匀，这是由于DNA解聚而产生的游离核酸分子从染色体扩散到细胞质中，使细胞普遍着色。随着时间的过度，会使水解液中的反应增强，而细胞不能着色。 (2)固定液的成分： 不同成分的固定液常出现不同的颜色反应。含铬酸的固定液产生红色，酒精-醋酸固定液产生红色、紫红色，只用酒精的呈现紫色，用含甲醛的固定液则呈现强烈的紫红色。当需要对染色体中的DNA 定量测量时，一般只能用不含金属离子和甲醛的固定液，如酒精-醋酸固定液等。 (3)SO2含量： Schiff试剂中的SO2含量也影响孚尔根反应的颜色表现。SO2含量