细胞生物学实验——步骤集解读.pptVIP

细胞生物学实验 ——步骤集 PEG促细胞融合法的步骤 （1） 取鸡血2ml+2ml Alsever液，再加入6ml Alsever液，混匀后制悬液。（可在4℃保存） （2）取(1)1ml+4ml 0.85%的NaCl溶液，进行以下三次离心处理： ①.1200 r/min离心5分钟。（去上清液，再加入至5ml的0.85%NaCl液） ②.1000~1200 r/min离心5分钟。（去上清液，再加入至5ml的0.85%NaCl液） ③. 1000~1200 r/min离心7分钟。 （3）将上步最后一次的沉降血球（去上清液后，约0.1~0.2ml），加入GKN液至1~2ml，使之成10%的细胞悬液。 （4）取上述10%的血球悬液1ml，加入3ml GKN液，使每毫升含血，即 。 （5）取（4）1ml+0.5ml 50%的PEG液，或取（4）0.5ml+0.5ml 50%的PEG液，或取（4）0.5ml+1.0ml 50%的PEG液，混匀滴片，在常温下2~3分钟后，镜下观察。 【细胞凝集反应实验步骤】 1.取土豆去皮块茎2克，加10mlPBS缓冲液，浸泡24小时，浸出的粗体液中即含有可溶性土豆凝集素。 2.抽取兔子静脉血（加抗凝剂）1ml，加生理盐水3ml，在1000r/min条件下，离心5分钟。重复三次离心，最后按压积红细胞体积用生理盐水配成1%的红细胞悬液。 3．分别用滴管吸取土豆凝集素和1%的红细胞悬液各一滴，置双凹片的左孔内，充分混匀。 4．同时分别用滴管吸取PBS缓冲液和1%的红细胞悬液各一滴，置双凹片右孔内，充分混匀，作对照实验。 5.摇晃5-10分钟后，观察有无发生细胞凝集并置显微镜下观察。 实验步骤—苏丹Ⅲ染色法 断头法处死小鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，用镊提起小肠将盖玻片紧贴于肠系膜，并在其下部置一载玻片，用剪连同盖玻片和其上粘的肠系膜取下，滴加甲醛钙于有标本的载玻片处，使标本润湿，固定20分钟。 吸蒸馏水滴入载玻片与盖玻片之间冲洗，用滴管不断吸去液体以去除固定液。 用70%乙醇溶液代替蒸馏水重复步骤2的操作，再进行一次冲洗。 用苏丹Ⅲ染色30分钟。 吸去溢出染液，擦净盖玻片表面及周边，显微镜观察。 原代细胞(脾细胞）培养步骤 1.取材： 取小白鼠一只，采用断头法处死；清水洗小鼠并浸于75%酒精中灭菌3分钟。取出转入超净洁净台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔。取出脾脏，去除其周围的脂肪组织，镊起脾脏用PBS液自上而下冲洗1—2次。转入无菌玻璃培养皿中，待用。 2．分离脾细胞： 用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS液30滴，再用“L”型针头注射器在皿中吸取PBS液0.2ml，然后将其沿脾长轴方向注射入脾内（使脾脏膨胀以利于细胞散开）。 用针尖在脾脏上扎眼，并用“L”针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的PBS液冲脾脏并吹散刮出的脾细胞，稍倾斜并静置1～2分钟。 吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入Eppendorf管，并使量至1ml，以3000转/分离心1～2分钟。 3．培养脾细胞： 超净洁净台中取塑料培养皿一个，用“枪（1ml）”加入细胞培养液2ml，并在皿盖上画上标记，待用。 取上述离心后的Eppendorf管，在超净洁净台内开盖弃去上清液，用“枪（200μl）”吸取塑料皿中的培养液400ml加入弃去上清液的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200ml脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入37℃、5%CO2培养箱中培养。 细胞生死状态的鉴别——台盼蓝（Trypan Blue）法 （1） 试剂配制：用生理盐水配制0.4%台盼蓝染液，备用。 （2） 细胞悬液制备：将生长有贴壁型细胞的培养瓶（皿）中的培养液倒入干净试管中，向培养瓶（皿）中加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液l～2ml,静置3～5min，待见到细胞变圆，彼此不连接为止，弃去混合消化液并将上述试管中的培养液倒回培养瓶中，用滴管轻轻吹打细胞，制成细胞悬液。 （3） 染色制片：取0.5ml细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液，混合，2min后制成临时装片，镜检。 （4） 染色结果：死细胞染成蓝色，活细胞不着色。 或者， （3） 染色计数：取0.5ml细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液，混合2～5min，滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜面上，使悬液自然充满计数板小室。注意不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加。在普通光镜10X物镜下计数四个大格内的细胞