人胎儿角膜内皮胞的体外培养和性质鉴定.pdf

摘 要 目的： 建立人胎儿角膜内皮细胞体外原代培养、传代培养和冻存复苏的方法，探索优 化人胎儿角膜内皮细胞的体外培养体系。 方法： ’ 一、人胎儿角膜内皮细胞原代、传代培养和冻存复苏方法及衰老细胞检测 l、原代培养 无菌操作获取胎儿角膜片，贴壁法(角膜片切割成周边和中央块分别贴壁)、揭 膜法和消化法进行原代细胞培养，培养液用DMEM／F12+lO％胎牛血清，常规条件培养。 2、传代培养及冻存复苏 分钟不等，按1：2比例传代接种，并常规换培养液培养。用90％胎牛血清加IO％DMSO 配制成细胞冻存液将培养的角膜内皮细胞冻存。 3、13一半乳糖苷酶原位染色 对出现衰老状态的P3代胎儿角膜内皮细胞，按试剂盒说明进行13一半乳糖苷酶 原位细胞染色，镜下观察染色情况。 二、胎儿角膜内皮细胞培养体系的优化 将传代内皮细胞以合适浓度接种于96孔培养板，第二日待细胞贴后分别换人 胎儿角膜基质细胞条件培养液、含2．5％、5％、10％、20％的牛角膜内皮细胞裂解液 能酶标仪读取各孑L细胞00490值。 三、胎儿角膜内皮细胞的鉴定 体进行荧光染色，观察传代细胞是否保持有角膜内皮细胞的特性，以角膜基质细胞 作为阴性