利用SSH方法筛选和鉴定AC3基因缺失小鼠主要嗅觉表皮内的差异表达基因.pdfVIP

Hereditas (Beijing) 2014 年6 月, 36(6): 574 ―583 研究报告 利用SSH 方法筛选与鉴定AC3 基因缺失小鼠主要嗅觉 表皮内的差异表达基因 1 1 1,2 3 1 3 3 4 曹振龙 , 郝江叶 , 周艳芬 , 张喆 , 倪志华 , 胡远想 , 刘伟丽 , 李永超 , 5 4 1,2 Daniel R. Storm , 马润林 , 王振山 1. 河北大学生命科学学院, 保定 071002; 2. 河北省生物工程技术研究中心, 保定 071002; 3. 河北大学基础医学院, 保定 071002; 4. 中国科学院遗传与发育生物学研究所, 北京 100101; 5. Department of Pharmacology, University of Washington, Seattle, WA 98195 摘要:腺苷酸环化酶3(Adenylate cyclase 3, AC3 )基因在小鼠主要嗅觉表皮(Main olfactory epithelium, MOE) 内 的嗅觉信号传导中起着重要作用, AC3 缺失是否会导致MOE 内与之相关的基因发生差异表达, 尚待确定。文章 利用抑制性消减杂交(Suppression subtractive hybridization, SSH)方法, 以AC3 敲除(AC3 -/ -)及其同窝出生的野生 型(AC3 +/+)小鼠 MOE 为材料, 构建了正向和反向两个消减文库, 采用斑点杂交对消减文库进行初步筛选, 对筛 选出的差异表达基因进行序列测定及生物信息学分析, 并利用荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对其进行验证。斑点 杂交筛选获得了386 个差异表达克隆, 随机选取其中的80 个进行DNA 序列测定, 经序列比对后发现有62 个在 GenBank 上获得了与之相匹配的基因信息, 其中24 个上调差异表达克隆对应于kcnk3 、mapk7 、megf11 等基因, 38 个下调差异表达克隆对应于tmem88b 、c-mip 、skp1a 、mlycd 等基因。利用Gene Ontology(GO)方法对这些差 异表达基因进行蛋白功能注释, 发现它们主要集中在分子结合、细胞周期、生物和细胞过程等功能方面。选取 其中上调基因 kcnk3 和下调基因 c-mip 、mlycd 、tmem88b 及 trappc5 进行 qRT-PCR 验证。结果表明, 在AC3 -/- 小鼠MOE 内kcnk3 的表达量显著上调, 是对照组小鼠的 1.27 倍, 而c-mip 、mlycd 、tmem88b 和trappc5 的表达 量显著下调, 为对照组小鼠的 20% 、7% 、32%和 29% 。这些基因的功能与 K+ 通道、细胞发育与分化、脂肪代 谢和膜蛋白转运等密切相关。推测它们可能与AC3 基因共同作用, 调节小鼠MOE 内的嗅觉信号传导信息。 腺苷酸环化酶3; 主要嗅觉表皮; 差异表达基因; 抑制性消减杂交 关键词: 收稿日期: 2013−11−24; 修回日期: 2014−01−16 基金项目: 国家自然科学基金项目(编号, 河北省自然科学基金项目(编号：C2012201106), 教育部留学人员回国启动基金项目(教外 司留2013693 号)和河北省生物工程重点学科经费资助 作者简介: 曹振龙, 硕士研究生, 专业方向：细胞分子生物学。E-mail: dafeizizhu@163.com 通讯作者: 王振山, 教授, 博士生导师, 研