基于SSA修复机制和特异性核酸酶活性检测的双荧光报告载体系统的开发及其应用.pdfVIP

Hereditas (Beijing) 2015 年 10 月, 37(10): 1053 ―1060 技术与方法 基于SSA 修复机制和特异性核酸酶活性检测的双荧光 报告载体系统的开发及应用 1 1,2 1 1 1 韩芙蓉 ，王令 ，徐坤 ，张智英 ，王昕 1. 西北农林科技大学动物科技学院，杨凌 712100 ； 2. 陕西理工学院生物科学与工程学院，汉中 723000 摘要:报告载体系统因构建快捷、改造简单、操作容易、经济有效，并且能通过介导筛选核酸酶阳性细胞富集 基因组修饰的阳性细胞克隆，而成为特异性核酸酶活性检测的重要手段。基于非同源末端连接(Non -homologous end joining ，NHEJ)修复机制的报告系统在引入DNA 双链断裂(Double strand breaks ，DSBs)后，经过优化最高 也只有2/3 的概率实现报告基因的修复；而单链退火(Single strand annealing，SSA)修复机制在引入DSBs 后， 理论上可以实现报告基因 100%的修复，具有更高的灵敏度，有利于活性较低的特异性核酸酶活性的检测，为 基因组修饰研究中特异性核酸酶活性的检测提供了有效的手段。本研究设计并构建了 3 套基于 SSA 修复机制 的双荧光报告载体系统，并应用mRFP-eGFP 系统检测了3 对ZFNs 的有效活性，其活性检测结果分别为8.9%、 9.3%和5.0% ，该研究为核酸酶活性的检测提供了有效的手段。 SSA；双荧光报告载体系统；特异性核酸酶 关键词: Development and application of dual-fluorescence reporter systems for measuring specific nuclease activity based on SSA repair mechanism 1 1,2 1 1 1 Furong Han , Ling Wang , Kun Xu , Zhiying Zhang , Xin Wang 1. College of Animal Science Technology, Northwest AF University, Yangling 712100, China; 2. School of Biological Science and Engineering, Shaanxi University of technology, Hanzhong 723000, China Abstract: Reporter vector system has become an important method for measuring activity of specific nucleas- es because of its fast construction, simple modification, easy operation, economic effectiveness as well as its role in enriching positive cells with genomic modification through mediating screen of specific nucleases positive cells. After in- troducing double strand breaks (DSBs), a reporter system based on non-homologous end joining (NHEJ)-mediated repair can only repair maximally two thirds of reporter genes after optimization, while single strand annealing (SSA)-mediated repair can repair all rep