RNA干扰α突触核蛋白对多巴胺能神经元的影响及机制.pdf

1JI尔人学博卜。≯何论艾 RNA干扰0c一突触核蛋白对多巴胺能神经元 的影响及其机制 博士研究生： 吴凤霞 博士生导师： 刘树伟教授 合作导师： 潘伟生教授 中文摘要 帕金森病(Parkinson’Sdisease，PD)是最早由JamesParkinson医生于1817 年报告并因此而得名的一种神经系统疾病。其临床症状有静止性震颤、肌肉强 直、随意运动减少和正常的姿势平衡反射丧失等。PD在60岁以上人群中患病 率约为1％～2％，是神经系统中的第二大变性疾病。随着社会老龄化进程的推 进，患病率还将继续升高。因此如何有效的预防和治疗帕余森病R益引起人们 的关注。 PD的病因尚不清楚，目前认为与线粒体功能异常、氧化应激等因素密切 相关。Schapira等首次报道PD病人的黑质内线粒体呼吸链复合物I活性降低， 之后，大量的文献报道PD病人的血小板、淋巴细胞及肌肉组织内都存在线粒 体呼吸链复合物I活性降低。因此PD的发病伴随着线粒体功能异常。而且用 复合物I的抑制剂鱼藤酮处理后，动物表现出PD样行为学改变，并且黑质纹 状体内出现类似PD的病理变化。研究表明PD病人细胞内的氧化产物如活性 氧簇(reactive oxygen GSH)水平降低，引起PD病人的黑质内多不饱和脂肪酸的浓度下降、脂质氧化 nonenal，HNE)浓度升高、可溶性蛋白的羰基修饰水平明显提高并且PD病人 脑内细胞核DNA和线粒体DNA中的脱氧鸟苷被氧化成8一羟脱氧鸟苷(8． 尔人‘’≯博卜jo何沦文 都处于氧化应激状态。 PD的主要病理变化包括黑质内多巴胺神经元死亡和残留神经元胞浆内蛋 突触核蛋白是一种突触前神经木梢蛋白，其生理作用尚不明确。据报道它可能 参与调节细胞的生长和分化、突触可塑性和递质的释放及参与某些信号传导通 可以导致家族性帕金森病症状。另外SNCA的二倍重复突变体和三倍重复突变 体也可以引起早发性遗传性帕金森症状，而且在三倍重复突变体家族比二倍重 复突变体家族发病年龄早、进程快，这说明0【一突触核蛋白表达量也与PD密切 相关。许多文献报道非家族性PD病人的脑内也出现a一突触核蛋白表达升高及 蛋白的异常积聚。体内和体外的研究也表明，过度表达0【一突触核蛋白会造成神 经元死亡。这些都提示Q一突触核蛋白在PD的发病中起重要作用，抑制其表达 可能会阻止或延缓多巴胺能神经元的死亡。 RNA干扰(RNA interference 达的方法。化学合成的小干扰RNA(small RNA．siRNA)是一种常 用的介导RNAi的双链RNA，与载体携带的短发央RNA结构(shortRNA， hairpin 减少0【一突触核蛋白表达并能抵抗1一甲基-4-苯基吡啶离子(1．methyl．4． ion，MPP+)引起的细胞活性下降，但是否影响了细胞线粒体的 phenylpyridinium 功能、凋亡调控因子表达及细胞内氧化应激水平未见报道。 本研究用采用了分子克隆、基因沉默和细胞培养等技术，构建出靶向cL一 突触核蛋白的shRNA重组质粒载体，转染细胞并筛选出稳定转染的细胞。利 bloaing、DCFH．DA法等方法探讨了干扰仅一突触核蛋白表达对帕会森病细胞 模型的形态改变、线粒体的功能、Bcl．2／Bax表达及细胞内的ROS和GSH 水平的影响。以期为PD的基因治疗提供可靠的实验依据，为PD的治疗提供 新思路。本研究分三部分，摘要如下： III尔人。引啦十。≯何论文 第一部分Pd卜lAi表达载体的构建及沉默效应的鉴定 目的：应用基因工程技术构建萃巴向0【一突触核蛋白基因的shRNA表达载体， 并将其转染SH．SY5Y细胞系，鉴定其沉默基因的效果。 方法： 1．构建靶向Q一突触核蛋白基因的shRNA表达载体。根据表达载体的要求和