DNAsanger测序法原理.pdf

DNA测序技术 覃振东 复旦大学生物技术中心 DNA测序 DNA是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸(dATP dTTP dCTP dGTP)。这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列，可组成遗传密码， 指导蛋白质的合成。测序分析能够为基因DNA序列提供最真实可靠的信 息，它可以比较全面地描述基因的复杂性和多样性。 测定未知序列 研究基因组多样性 确定重组DNA的方向与结构 对突变进行定位和鉴定 DNA测序的发展历程（1） 经典DNA测序技术 70年代末，Maxam和Gilbert发明化学法、Sanger发明双脱氧终 止法手动测序（同位素标记） 80年代中期，出现自动测序仪（应用Sanger双脱氧终止法原 理）、荧光代替同位素，采用计算机图象识别 90年代中期，测序仪重大改进、集束化的毛细管电泳代替凝胶 电泳 2001年完成人类基因组框架图，全部采用基于Sanger双脱氧原 理的自动化毛细管测序。 DNA测序的发展历程（2） 新测序方法 杂交测序法 质谱法 单分子测序法 原子探针显微镜测序法 流式细胞仪测序法 大规模平行实测法、DNA芯片法 边合成边测序法(二代测序) Maxam-Gilbert化学法测序 基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的 DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不 同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自 显影之后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。 Sanger双末端终止法测序 1977年，英国人Frederick San ger 创建了双脱氧链末端合成 终止法（chain termination m ethod），简称Sanger法、双脱 氧法或酶法。他发现如果在DNA 复制过程中掺入ddNTP，就会产 生一系列末端终止的DNA链，并 Frederick Sanger：1980年 能通过电泳按长度分辨。不同 因发明测序技术获得诺贝尔化学奖 末端终止DNA链的长度是由掺入 到新合成链上随机位置的ddNTP 决定的。 Sanger双末端终止法测序 基本原理是利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，以 dNTP为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每 个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸 （dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP）作为 链延伸终止剂。在测序引物引导下，按照碱基配对原则， 每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链，通 过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显 影检测后，从凝胶底部到顶部按5′→3′方向读出新合 成链序列，由此推知待测模板链的序列 。 DNA复制是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。 A T A T G C G C G C G C T A T A A T