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中南大学生物科学与技术学院 分子生物学研究中心 教 案 授课科目: 授课内容:授课对象：临床医学年制年制授课时数：学时授课：授课地点：授课时间：多媒体教学多媒体课件 有聚合酶活性, 3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性, 5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性。 2. DNA聚合酶Ⅰ大片段 DNA聚合酶Ⅰ大片段(large fragment of DNA polymerase I)为DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)裂解后产生的大片段，这个片段也称为Klenow片段（Klenow fragment）。 有5ˊ→3ˊ聚合酶活性, 3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性, 无5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性 Klenow片段的主要用途有： (1) 补齐双链DNA的3ˊ末端。 (2) 通过补齐3ˊ端，使3ˊ末端标记。 (3) 在cDNA克隆中，第二股链的合成。 (4) DNA序列分析。 3. 逆转录酶（reverse transcriptase） 是一种RNA依赖的DNA聚合酶，即以RNA为模板合成DNA，合成时需要四种脱氧核苷酸及3ˊ-OH引物，合成方向为5ˊ→3ˊ延伸，无3ˊ→5ˊ外切酶活性。广泛用于以mRNA为模板合成cDNA，构建cDNA文库。 4. T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase） T4 DNA连接酶催化双链DNA一端3ˊ-OH与另一双链DNA的5ˊ端磷酸根形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平端的DNA两端连接起来。 5. 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase） 能去除DNA或RNA 5ˊ端的磷酸根。制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接，提高重组效率。 6. 末端脱氧核苷酸转移酶 末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT），简称末端转移酶。它的作用是将脱氧核苷酸加到DNA的3ˊ-OH上，主要用于探针标记；或者在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接。 第二节 基因克隆的载体 外源DNA一般没有明显的遗传标志，如果将其直接导入宿主细胞，没有有效的方法将导入了外源DNA片段的细胞和没有导入外源DNA的细胞区分开来。此外，外源DNA导入宿主细胞后，不能随宿主细胞的繁殖而复制，即没有自主复制能力，达不到使外源DNA片段扩增的目的。如果要将外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达，就需要有一个能在该宿主细胞内进行自我复制和表达的载体(vector)来携带。外源DNA片段与载体在体外连接，构成重组分子，然后导入宿主细胞，使之进行扩增或表达。 一、质粒（plasmid） 质粒是存在于多数细菌和某些真核生物染色体外的双链环状的DNA分子。 质粒含有复制起始点，此复制起始点与其他一些顺式调控因子构成复制子，能利用细菌染色体DNA复制和转录的同一套酶系统，在细菌体内独立地进行自我复制及转录。 作为克隆载体的质粒应具备下列特点： （1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。 （2）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主细胞进行选择，如抗生素的抗性基因，β-半乳糖苷酶基因（Lac Z）等。 （3）具有多个限制性内切酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。 质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段。 二、λ噬菌体 噬菌体(bacteriophage, phage)是感染细菌的病毒， 用作克隆载体的噬菌体有两种：一种是λ噬菌体，另一种是M13噬菌体。 野生型λ噬菌体经过改造，已衍生出100多种克隆载体。 λ噬菌体载体分为插入型和替换型(置换型)两类。 目前应用较广的是EMBL系列、λgt系列和Charon系列等。 λgt10和λgt11载体适用于建立cDNA文库。这两个载体都属插入型载体，能克隆7kb以下的外源DNA。 λgt11为表达型载体。 三、粘性质粒（cosmid） 粘性质粒是由λ噬菌体的噬菌体的粘性末端（cos区）与质粒重新构建的载体，为双链、环状DNA。其克隆容量可达40～50kb。 四、M13噬菌体 M13噬菌体（M13 phage）是一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体，全长约6.5kb。M13感染细菌后，经过复制转变为双链的复制型（RF）。复制型M13可用作克隆载体。 当每个细菌体内的复制型M13拷贝数积累到100～200后，M13的合成就变得不对称，只有其中一条链进行复制，产生大量的单链DNA，并被包装到成熟的噬菌体颗粒中，然后从细菌中排出。M13噬菌体的最大优点在于从细菌体