cks1、ck2对人类肝癌细胞系hepg2增殖与凋亡的影响.pdfVIP

1 万方数据 目 录 1.中文摘要 ……………………………………………………………03 2.英文摘要 ……………………………………………………………05 3.主要英文缩略图表………………………………………………… 07 4.引言 …………………………………………………………………08 5.实验材料 ……………………………………………………………10 6.实验方法 ……………………………………………………………15 7.实验结果 ……………………………………………………………25 8.讨论 …………………………………………………………………36 9.结论 …………………………………………………………………40 10.参考文献……………………………………………………………41 11.致谢…………………………………………………………………44 12.综述…………………………………………………………………45 2 万方数据 Cks1、Cks2 对人类肝癌细胞系 HepG2 增殖与凋亡的影响 中文摘要 目的： 研究 CKs1、CKs2 对肝癌细胞 HepG2 增殖、凋亡及细胞周期调控的影响，探 究肝细胞癌致病机理，为肝细胞癌临床治疗提供新的线索。 方法： 1、设计并合成分别针对 Cks1、Cks2 基因的 SiRNA 序列，以脂质体介导，转染肝 癌细胞株 HepG2，干扰目的基因的表达； 2、构建分别针对 Cks1、Cks2 基因的 pcDNA3.1/Hygro-IRES2-EGFP 质粒载体，使 用脂质体介导，转染肝癌细胞株 HepG2，增强目的基因的表达，建立过表达稳定 转染细胞系； 3、转染后收集细胞，应用 real-time PCR 分别检测 Cks1、Cks2 mRNA 表达水平。 应用 western blot 分别检测 Cks1、Cks2 蛋白质表达情况。 4、运用 CCK-8 和细胞计数方法检测干扰和增强后细胞的增殖情况； 5、应用Annexin-V/PI 双染细胞，以顺铂诱导细胞凋亡，流式细胞术分析干扰和 增强后细胞凋亡情况。 6、使用 PI 染色，流式细胞术分析干扰和增强后细胞周期变化。 7、选取若干个与细胞生存、增殖密切相关的蛋白质——Akt、GSK-3 β、Bcl-2， 在目的基因干扰后进行 western blot 检测，观察蛋白表达的变化。 结果： 1、RNA 干扰后 24-96 小时，Cks1、Cks2 mRNA 和蛋白表达水平明显下降，蛋白 水平以转染后 48 小时干扰效果最佳。 2、筛选出 Cks1、Cks2 过表达稳定细胞系。 3、CCK-8 和细胞计数检测显示：干扰细胞内源性 Cks 蛋白之后，HepG2 细胞的 增殖速度减慢；而过表达 Cks 蛋白能够促进细胞增殖。 4、细胞凋亡流式检测结果显示：HepG2 细胞的凋亡率随着 Cks 蛋白表达的下调 而增高；Cks 蛋白表达水平的升高，使细胞凋亡率减少。 5、周期实验分析表明：过表达 Cks1，能够促进HepG2 细胞由 G0/G1 期进入 S 期。 6、Akt、GSK-3 β蛋白的磷酸化部分pAkt、pGSK-3 β在Cks1、Cks2 RNA 干扰后， 3 万方数据 表达出现下降的趋势，差异具有统计学意义。Bcl-2 蛋白表达水平并未出现明显 的改变。 结论：