16s rdn t-rflp快速分析慢性腹泻患者肠道菌群及其应用研究.pdfVIP

rDNA 16S T-RFLP快速分析慢性腹泻患者 肠道菌群及其应用研究 硕士研究生：詹銮峰 指导教师：张卓然 教授 专业名称：临床检验诊断学 摘 要 人体肠道微生物菌群是一个极其复杂的微生态系统，含有400多 种不同种类的细菌。其中以厌氧菌为主，不同菌群之间相互制约，相 互依存，共同维持着生态平衡。这种平衡对机体正常的消化、吸收、 代谢、抵御外来致病菌的侵袭等功能具有重要意义。因此建立快速检 测分析人体肠道菌群的方法对于协助慢性腹泻诊断指导临床合理使用 抗生素，保持肠道菌群动态平衡无疑十分必要。传统的肠道菌群分析 需要不同的细菌培养技术，然后进行生化反应鉴定。而且许多微生物 需要复杂的营养条件，培养操作费时、费力，因此导致大多数微生物 不能培养存活。近年来发展了许多分子生物学的方法来克服这些缺点， 尤其是16SrDNA基因集保守性与变异性于一身，成为目前应用最广的 分子微生物学检测的靶基因，已被众多学者用来对细菌的快速鉴定。 为了有效利用上述基因，我们筛选出一对通用引物，再配合使用毛细 管电泳技术应用于肠道菌群检测，目的是使一次实验在～个混合样品 中能同时检测出多种细菌，有助于快速分析肠道复杂菌群的结构。方 法是其中一个引物5’末端用6-FAM进行荧光标记，而另～个引物不进 行标记。PCR反应结束后选择适当的限制性内切酶酶切消化，在测序 仪上通过毛细管电泳即可检测5’末端荧光标记的限制性片段，从而克 PRISM 服了产生大量酶切片段的问题大大使结果简化。ABI 310测序 仪GeneScanSoftware分析得出片段峰的大小和面积等数值。 Analysis ·1’ 利用不同细菌产生的不同峰谱达到快速对细菌定性、定量的目的。本 实验应用该法对30例慢性腹泻患者和22例健康人进行肠道菌群分析， 从而探讨菌群变化情况。经过分析后发现，健康人肠道菌群中以厌氧 菌为主，这与20世纪60年代中期以前的说法不同，当时由于厌氧菌 技术不完善，过去被认为是主要优势菌的大肠杆菌，在实际上为少数， 居于次要地位。结肠内寄生的优势菌种均能够同时被检测出来。该法 能够对人体肠道菌群进行定性和定量分析，30例慢性腹泻患者均未发 现特异的病原菌，而优势菌群的种类和比例均发生了改变，提示发生 了肠道菌群紊乱。因此我们建议对不明原因的腹泻要及时对肠道菌群 进行监测，动态观察，避免抗生素的盲目使用，有效避免耐药菌株的 产生。本文证实：利用16S rDNA基因建立的末端限制性酶切片段长度 Restriction 多态性(Terminal Fragment Length 术进行肠道菌群分析，快速、特异、敏感。能够检测难以培养的厌氧 菌。并且一个含有混合未知微生物的复杂样品能同时检测出多种细菌， 而不需要针对不同细菌设计不同引物，所以是一种极具临床应用价值 的新技术。 关键词：16SrDNA聚合酶链反应末端限制性酶切片段长度多态性 肠道菌群厌氧菌 chronicdiarrhoeal microflorain intestinal of Rapidanalysis and 16SrDNAterminalrestriction studyby patientsapplication r