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第九章 DNA重组与遗传转化 本章重点：内切酶、基因克隆、遗传转化。 本章难点：酶切片段的多态性、基因的重组。 第一节??核酸酶和限制性内切酶 核酸分解的第一步是水解核苷酸之间的磷酸二酯键，在微生物和高等动植物中都有作用于磷酸二酯键的核酸酶。不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。有些核酸酶只能作用于RNA，称为核糖核酸酶（RNase），有些核酸酶只能作用于DNA，称为脱氧核糖核酸酶（DNase），有些核酸酶专一性较低，既能作用于RNA也能作用于DNA，因此统称为核酸酶（nuclease）。根据核酸酶作用的位置不同，又可将核酸酶分为核酸外切酶（exonuclease）和核酸内切酶（endonuclease）。 第二节?? 基因的克隆与重组 一般而言， 一个基因是编码一条多肽链的一个DNA片段，包括启动子、终止子及内含子等。在基因克隆和DNA重组技术出现之前，由于DNA分子量大而结构单一，DNA是细胞中最难分析的大分子。基因克隆和DNA重组技术出现之后，DNA已成为细胞中最易操作分析的大分子。利用这一技术，可从一个含有10万个基因的大基因组中，准确地分离出特异的单个目的基因。 　　DNA的体外重组是指通过酶的修剪和连接，使目的DNA分子与载体DNA共价连接获得重组DNA分子的过程。 　　其中分离与鉴定目的基因是DNA重组中的关键步骤之一。 第三节?? 遗传转化的原理与方法 　　重组DNA分子需导入宿主细胞才能进行增殖或表达。通过筛选转化细胞获得带目的基因的细菌后，可将其不断进行增殖，从而得到大量的目的基因片段用于分析研究；如果在目的基因的上游带有启动子顺序，则目的基因还可转录表达合成蛋白质。 思考题 1．什么是DNA重组？其操作过程如何？ ２．什么是限制性内切酶？限制性内切酶有何主要特点？ ３．分离目的基因的方法主要哪些？常用载体有哪些？ ４．叙述遗传转化的原理与方法。 3．柯斯质粒(cosmid) 　　　部分λ噬菌体DNA与部分细菌质粒DNA序列组建成柯斯质粒。 　这种质粒分子量较小，但可接受长达50kb的外源DNA片段，在克隆真核生物基因中十分有用。因为一个长片段DNA可能具有真核生物基因的编码序列及其它调控序列。 4．穿梭载体（shuttle vectors） （1）穿梭载体是指能在两种不同的生物中复制的载体。如能在原核生物（如E. coli）、真核细胞（如酵母）中复制的载体。 （2）穿梭载体需同时具有细菌质粒的复制原点、真核生物自主复制序列(Auto-nomously replicating sequence, ARS)以及两者的选择标记。 （3）穿梭载体在细菌中用于克隆、扩增基因，在酵母菌中用于基因表达分析。 （4）例如：酵母菌的YEp （yeastepisomaplasmid）和YRp系列载体均是穿梭载体。 5.细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome，BAC) (1) BAC载体是基于细菌的性因子(F因子)质粒的一些特点构建的。F因子是细菌细胞内能自我复制的质粒，约100kb，它能在细菌接合时转移1000kb的细菌染色体片段。将F因子经基因工程改良构成的BAC载体，可用于克隆100 kb以上的DNA片段。 （２）特点：带有外源DNA的BAC载体在细胞中是单拷贝的；载体本身分子量很小(7.4kb)；具有选择标记性基因（氯霉素抗）和多克隆位点。 ６.酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC) （1）YAC具有自主复制序列、克隆位点和可在细菌和酵母菌 中选择的标记基因；还具有酵母菌染色体一些特点；可接受100-1000kb的外源DNA片段。 （２）特点：带有外源DNA的BAC载体在细胞中是单拷贝的；载体本身分子量很小(7.4kb)；具有选择标记性基因（氯霉素抗）和多克隆位点。 （３）YAC已成为人类基因组计划和图位克隆基因的重要工具； 并促进了人类人工染色体(human artificial chromosome，HAC)的研究。 ７．Ti质粒及其衍生载体 （1）Ti质粒是一种细菌质粒，它自然存在于土壤农杆菌(革兰氏阴菌)(Agrobacterium tumefaciens)细胞中?可诱导植物产生瘤细胞(tumor-Inducing, Ti) ?冠瘿瘤(grown galltumors)。 （２）适合于植物的载体系统?将重组DNA运载到植物细胞并使目的基因表达。 （３） Ti质粒一部分DNA叫转移DNA (transfer DNA，T-DNA)，当农杆菌感染植物时，T-DNA便转移到植物的染色体上，诱导冠瘿瘤，并能合成冠瘿碱(opine)，作为农杆菌的碳源和氮源。 （4）Ti质粒特点 a. Ti质粒具有五个主要