大鼠骨髓间充质细胞移植治疗糖尿病大鼠的研究.pdf

中文摘要 大鼠骨髓问充质干细胞移植治疗 糖尿病大鼠的研究 摘 要 目的：通过大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养，选择 一种简便、有效的分离、纯化方法；通过检测移植治疗后雌 性糖尿病大鼠血糖、C．肽的变化，及胰腺冰冻切片细胞DAPI 标记，胰腺石蜡切片原位杂交显示Y染色体标记情况，进一 步揭示骨髓间充质干细胞转化为胰岛样细胞的机制；通过比 较骨髓间充质干细胞在腹腔注射、尾静脉注射、肾包囊注射 几种不同移植部位，寻找一种最佳的移植部位，为糖尿病的 细胞治疗提供新的思路和方法。 方法：1以密度梯度离心法结合贴壁细胞分离法分离纯 化雄性大鼠骨髓间充质干细胞，传代扩增，相差显微镜下形态 学观察，待骨髓间充质干细胞培养至3代或3代后，给于细 胞DAPI标记，倒置荧光显微镜下观察细胞核染色情况。 2将雌性糖尿病大鼠随机分为4组(各组10只)：①对 照组，腹腔注射PBS O．2ml，②腹腔注射骨髓间充质干细胞组， 腹腔注射经DAPI标记后骨髓间充质干细胞o．2ml，③尾静脉 注射骨髓间充质干细胞组，尾静脉注射经DAPI标记后骨髓 间充质干细胞O．2ml，④肾包囊注射骨髓间充质干细胞组。右 侧肾包囊下注射经DAPI标记后骨髓间充质干细胞0．2ml。 3采用血糖仪分别于各组在注射骨髓间充质干细胞或 PBS前及注射后第3、5、7天采集尾静脉血检测血糖，采用 放射免疫法分别各组于注射骨髓间充质干细胞或PBS前割 中文摘要 尾收集血、及注射后7天心脏取血检测C．肽水平。 4治疗后1周处死各组大鼠取胰腺组织作冰冻切片、石 蜡切片，倒置荧光显微镜下观察胰腺冰冻切片中的DAPI标 记的细胞核染色情况，原位杂交技术检测雌性大鼠组织胰腺 石蜡切片中的含有Y染色体的细胞。 5统计学采用单因素方差分析、t检验，显著差异性为P 0．05。 液，将得到的球形单个核细胞接种于25cm2塑料培养瓶中， 24小时后部分细胞贴壁生长，至培养第3代通过全量换液逐 渐去除残留的各种血细胞，贴壁生长的细胞成单个分散存在 或形成数个细胞克隆，呈梭形。原代培养7．10天细胞生长达 80％融合，用0．25％胰酶一0．03％EDTA消化，按1：3传代， 传代后的骨髓问充质干细胞形态与原代相似，生长4．5天达 融合，继续传代扩增。待骨髓问充质干细胞培养至3代或3 代后，给于细胞DAPI标记，倒置荧光显微镜下可见兰色荧 光，与平片重叠后可见兰色荧光位置位于细胞核。 2血糖结果显示，对照组、腹腔注射组治疗后第3天、5 天、7天血糖值较治疗前显示无明显下降(PO．05)；尾静脉 注射组、肾包囊注射组治疗后第3天、5天、7天血糖值较 治疗前显示有明显下降(P0．01)。与对照组相对应时间比 较，腹腔注射组治疗后血糖无明显下降；尾静脉注射组第7 天血糖下降(PO．05)，尾静脉注射组第3天、5天、肾包 囊注射组第3天、5天、7天血糖下降明显(P0．01)。 3C．肽值结果显示，对照组、腹腔注射组治疗后与治疗 前相比C．肽值无上升(P0．05)：尾静脉注射组、肾包囊注 中文摘要 射组治疗后与治疗前相比C。肽值有所上升(p0．01)。与对照 组相对应时间比较，腹腔注射组治疗后C．肽值无明显改变(P 0．05)；尾静脉注射组、肾包囊注射组治疗后C．肽值明显 升高(p0．01)。 4对照组、腹腔注射组、尾静脉注射组胰腺组织冰冻切 片倒置荧光显微镜下均未见兰色荧光存在，肾包囊注射组胰 腺组织冰冻切片中荧光显微镜下可见兰色荧光存在，提示该 组织切片中具有来源于骨髓的DAPI标记的骨髓间充质干细 胞细胞。 5倒置荧光显微镜下观察对照组、腹腔注射组胰腺组织 石蜡切片中均未见黄绿荧光存在，尾静脉组及肾包囊组中倒 置荧光显微镜下胰腺组织中均可见黄绿荧光存在，存在于胰 腺腺泡间隙，提示来源于雄性大鼠的骨髓间充质干细胞细胞 在尾静脉注射及肾包囊注射的途径下可到达雌性糖尿病大 鼠胰腺组织。 结论：1采用密度梯度离心法结合贴壁细胞分离法分离 骨髓间充质干细胞，可得到数量较多、纯度较高的骨髓间充质 干细胞。 2雄性大鼠骨髓间充质