大鼠骨髓基质细在温敏型壳聚糖水凝胶中的生长观察.pdf

中文摘要 大鼠骨髓基质细胞在温敏型壳聚糖 水凝胶中的生长观察 摘 要 目的：组织工程的常用方法是，将种子细胞种植于一种 生物相容性良好并可被人体逐渐降解吸收的生物材料上进 行扩增，形成细胞／生物材料结构物后回植体内修复受损组 织。此时生物材料支架为细胞提供生存所需的三维空间，对 细胞的有序构筑起接触、引导及支架作用，使细胞能在预先 设计的三维形状支架上生长。骨髓基质细胞(MSCs)在体内 及体外具有向神经细胞分化的潜能，其具有来源广泛、易于 培养和自体移植不引起排斥反应、不涉及伦理问题等优点， 是构建组织工程的理想种子细胞来源。为寻找理想的组织相 容物，本实验观察MSCs在壳聚糖／B一磷酸甘油钠(C／GP)凝 胶中的存活和生长，有望为微创方式修复脑损伤摸索一种新 的可注射性组织工程MSCs，为应用自体干细胞移植寻找较 合适的可注射性载体提供实验依据。 件下取双侧股、胫骨的骨髓，用贴壁培养法分离出MSCs， 进行培养，并传代扩增以纯化MSCs，并连续观察细胞形态 及生长特性。 2室温状态下用吸管将B一甘油磷酸钠溶液缓慢滴入壳聚糖 溶液中，边滴加边混匀，按照(9-1)：1梯度体积比配置成 C／GP复合溶液，分别测混合液的PH值及37。C条件下的凝固时 间(以凝胶在容器内倒置90。不流动、不变形为凝胶形成的 中文摘要 标准)，选择最适混合比。 的细胞-c／Gp复合物，置37℃孵箱t0rain形成凝胶后，每孔加 入完全培养液0．1ml，每日换液。隔日在倒置显微镜下观察 MSCs三维培养。 4制各单细胞悬液加完全培养基，接种于96孔培养板，每 孔20“1细胞悬液加C／GP复合物10／tl，设为实验组；每孔取 2吮I细胞悬液加l吼l完全培养基，设为细胞对照组；每孔取 1吼lC／GP复合物加完全培养基2叻1，设为C／GP对照组。从 第2天起，24h后每组取3孔细胞用酶标仪测OD值，连续 7d，绘制生长曲线分别。对两组的OD值作t检验，进行统 计学分析 结果：1分离出的MSCs呈圆形，约72h后绝大多数细胞 已贴壁，细胞形态为梭形，多角形，约7～10天可达80％融合， 此时细胞呈长梭形，传代细胞较原代细胞成长快，约3～7天 基本铺满瓶底。 2在室温时，C／GP溶液呈半透明状态，具有流动性：在升温至 37℃后，C／GP溶液变成白色不透明固体状，失去了流动性。 温度的上升造成系统的溶胶／凝胶转变。而随着壳聚糖与8一 甘油磷酸钠的体积比的变化，C／GP溶液的PH值及37。C凝 固时间亦不同(见附表2)。 3接种于C／GP复合物24h后见细胞成球状，未见明显梭形及 多角形细胞，48h内生长速度较慢，72h后可见梭形，多角形 细胞，细胞数量明显增多。 4通过绘制MSCs生长曲线，可得出两条“S”形曲线，实 中文摘要 验组的细胞潜伏适应期为第1个24h，第2～3个24h为对数 生长期，5天后细胞增殖减慢，6天后细胞基本停止生长。 而细胞对照组的细胞潜伏适应期为第1~2个24h，对数生长 期推后至3—5个24h，1周后细胞基本停止生长。经过统计 学分析，认为实验组和对照组的OD值无差异，MSCs在C／GP 凝胶(体积比3：2)中可良好存活、增殖。 结论：1MSCs在体外培养条件下具有很强的增殖能力， 生长特性稳定。 2壳聚糖／B一甘油磷酸钠混合物在室温状态下为液态，调整 不同体积LL370C凝固时间可有差别，为温敏型壳聚糖水凝胶。 3MSCs在C／GP凝胶(体积比3：2)中可良好存活、增殖， 凝固时间为10分，较好地满足可注射支架材料的要求，温 敏型壳聚糖水凝胶可作为组织工程中良好的可注射型载体。 关键词：B一甘油磷酸钠；骨髓基质细胞；壳聚糖；组织 工程；组织相容物 英文摘要 TheObservationofRat Stem Mesenchymal CellsCulturedinThermosensitive Chitosa