第十一章流式细胞术资料.pptVIP

流式细胞术（flow cytometry ，FCM）是以流式细胞仪作为检测工具，结合激光光学、计算机、电子物理学、流体力学、细胞化学和免疫学等学科的理论与技术，对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分析和分选的高新技术 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等 流动室——仪器的核心部件，待测样品与激光在这里相交，通常由有机玻璃、光学玻璃或石英等制成。 流动室内充满了鞘液，使细胞排成单列进入流动室喷嘴口，形成细胞液柱。 液流驱动系统：包括压缩空气泵、压力传感器、鞘液过滤器和样本压力调节器等。 常用的液流系统中细胞流和鞘液流的驱动一般采用正压的方法控制的，保证了鞘液的流速恒定。 鞘液以匀速通过流动室，因此整个液流系统运行流速是不变的。 光学系统：主要由多组透镜、滤光片和分光镜等光学元件组成，将不同波长的光信号送入不同的探测器 散射光信号：分为前向散射光（forward scatter，FSC）和侧向散射光（side scatter，SSC）。 散射光不依赖于任何细胞样品的制备技术，被称为细胞的物理参数，反映的是细胞的大小的内部结构。 荧光信号：当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返回基态时，染料释放出能量，大部分以光的形式释放。 特异性荧光探针与单克隆抗体结合后，与细胞膜或细胞内的靶抗原结合，经染色后的细胞在激光的照射下，荧光染料发出比激发光波长长的荧光，检测荧光素信号的强弱就可以了解抗原表达量的多少。 当单细胞悬液形成液柱通过流动室时，液柱被分割成一连串均匀的液滴。 根据设定的被分选细胞的某个参数由逻辑电路判断是否被分选。 充电电路对选定细胞液滴充电，使其带正电荷或负电荷，未被设定分选参数的细胞液滴则不带电荷。 带电细胞液滴通过静电场而发生偏转，落入收集器中，其他液体则被当作废液抽吸掉，完成细胞分选的目的。 每秒可分离所要细胞的个数，一般要求分选速度至少达5000个/秒左右。 流式细胞仪的应用已从科研进入了临床，在进行科研和临床检验定量分析过程中，应明确各项工作环节的影响因素并对仪器性能进行严格的质量控制，以保证检测数据的准确性和可靠性。 确保标本上机检测前细胞浓度满足仪器检测要求。 荧光抗体染色后需充分洗涤，注意混匀、低速离心，减少重叠细胞和细胞碎片。 避光染色，保证细胞免疫荧光的稳定。 必须根据具体实验目的设置必要的对照，确保实验结果的准确性和客观性，消除非特异性荧光的影响。 判定结果时，应注意减去本底荧光，可应用计算机程序软件，使定量分析更精确。 在流式细胞术实验过程中，实验的每一个环节都会存在很多不稳定的因素，因此必须严格做好质量控制工作，从而保证实验的科学性和可靠性。 能否制备出合格的单细胞悬液是关系最终分析结果准确与否的关键。 单细胞悬液大多来自生物样品，不同组织来源的样本制备方法也不同。 流式细胞术主要是以某一类细胞群为检测对象，减少检测时的干扰因素。 新鲜的外周血是天然的单细胞悬液。 单次密度梯度离心法是最常用于分离制备单个核细胞悬液，采用淋巴细胞分离液分离外周血中的单个核细胞。 培养细胞一般是以悬浮或贴壁的方式生长。 将新鲜实体组织进行单细胞悬液的制备是一项困难而复杂的技术。理想的状态是既要达到分离细胞的目的又要不损伤细胞。 最常用的方法是酶消化法、机械法、化学处理法和表面活性剂处理法等。 不论是哪种方法都不可避免的会对细胞表面膜结构、细胞活性和功能等造成不同程度的损伤。 该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应用范围，有利于进行临床回顾性研究和利用。 常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡法和甲氧-双氧水处理法。 对石蜡切片的要求较严格。 活检标本及各种内镜取材标本也克制备成单细胞悬液。 一般要求镜检取材标本至少取3块以上。 制备方法与新鲜实体组织基本相同。 脱落细胞应去除取材伴随的杂质后，再制备单细胞悬液。 脱落细胞用流式细胞术检测，是一种更为客观的检测手段，对临床诊断和治疗很有意义。 FCM主要的信号参数包括散射光信号和荧光信号，荧光染色是保证荧光信号产生的关键步骤。 目前间接免疫荧光染色已较少用；直接免疫荧光染色以双色以上分析较为常用。 单色免疫荧光多用于单克隆抗体特异性较高、单一细胞群的抗原检测，多色免疫表型分析宜采用同一品牌的试剂。 直接免疫荧光染色法是荧光抗体技术最基本、最简单的方法，多用于细胞表面标志的染色分析。 已知未标记的特异性抗体（一抗）与待测抗原反应，再用荧光素标记的抗免疫球蛋白抗体（二抗）进行标记染色，通过对荧光素标记的二抗所发射的荧光信号进行检测，对标本中待测抗原进行鉴定。 多色流式细胞仪的开发促进了新的荧光染料的合成及抗体标记物的发展。 多色标记简便、省时、