第四节亲和层析资料.pptVIP

第四节 亲和层析 纯化大分子物质的方法的依据是根据理化特性的差异性。如果这种差异性较小，要得到纯度稍高的物质，常需繁琐的操作，需较长时间，而收得率低。随着生化技术的发展，人们找到了一个有效的分离方法，即亲和层析法。1967年Axen等发明的用溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋白质的方法，在亲和层析中得到采用，解决了固相载体的制备问题，这就使酶类等大分子物质的纯化过程变得较简单、迅速和效率高。目前，它己得到了广泛的应用。 一 基本原理 欲分离的大分产物质S和相对应的专一物质L(配体)以次级键结合，能生成一种可解离的络合物L-S。其中的L又能与活化的基质M以共价键首先结合，而形成M-L-S复合物。根据L-S之间能可逆地结合与解离的原理发展起来的层析方法称为亲和层析法(Affinity Chromatography)。 亲和层析的原理与抗原-抗体、激素-受体和酶-底物等特异性反应的机理相类似。每对反应物之间都有一定的亲和力。正如酶与底物的反应中，特异的底物(S′)才能和一定的酶（E)结台。产生复合物（E-S′) —样。在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。而亲和层析与酶-底物反应不同的是，前者进行反应时，配体(类似底物)呈固相存在，后者进行反应时，底物呈液相存在。 亲和层析实质：是把具有识别能力的配体L(对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等)以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M(如活化琼脂糖等)上，制成亲和吸附剂M-L，前者叫做固相载体，而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。 当把固相载体装入小层析柱(几毫升到几十毫升床体积)后，让欲分离的样品液通过该柱。样品中对配体有亲和力的物质S可借助静电引力、范德瓦尔力及结构互补效应等作用吸附到固相载体上，而无亲和力或非特异吸附的物质被缓冲液洗涤出来，形成第一个层析峰。再改变缓冲液的pH值或增加离子强度或加入抑制剂等，可把物质S从固相载体上解离下来，形成了第二个层析峰。这样就可把有效成分与杂质分开。 如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力(其大小有差异)时，采用选择性缓冲液进行洗脱，也可将它们分离开。用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。 分 类 特异性配体亲和层析法。 配体为复杂的生命大分子物质(如抗体、受体和酶的类似底物等)，它具较强的吸附选择性和较大的结合力。 通用性配体亲和层析法。 配体为简单的小分子物质(如金属、染料以及氨基酸等)，它成本低廉、且有较高的吸附容量，通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。 如：六连续组胺酸配合镍亲和性层析进行重组蛋白质的纯化。 优 点 1）亲和层析的分辨率高。因为将琼脂糖基质装入上述的小层析柱中，不论加入何种样品液都只能得到一个层析峰。 2）操作步骤少，活力不易丧失。 适用：分离纯化蛋白质，核酸和激素等物质。 缺点：要分离一种物质必须找到适宜的配体，并将其制成固相载体。 二、操 作 极低的非特异吸附性。 高度的亲水性。亲和吸附剂要易与水溶液中的生命大分子接近。 有较好的理化稳定性。当配体固化和各种因素作用时（如pH，离子强度，温度和变性剂等），基质很少甚至不受影响。 具有大量的化学基团，能有效的被活化，而且容易和配体结合。 具有适当的多孔性(即孔径大小和筛孔多少)。 具体要求须根据分离物的性质而定。当分离物与配体亲和力弱时，选用多孔性好的基质可提高结合容量；当分离物与配体亲和力大、或者分离物呈颗粒状或碎片状时，则选用多孔性差的基质对提高分离效果有利。 一般亲和吸附剂的基质：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖以及多孔性的玻璃珠。 商品纤维素具有不可忽略的吸附性，且结构不均一。 聚丙烯酰胺凝胶和交联葡聚糖与配体结合后，多孔性大大降低，同时前者具有大量的酰胺基，不易在载体和配体之间引入间隔物。 玻璃珠具有多孔性好、机械性能强的特点，但对某些物质也有一定的吸附力。 交联琼脂糖由于交联后降低了羟基数目，因而导致配体的结合数目减少。 实践中基质：聚丙烯酰胺凝胶(Bio-300)、多孔性玻璃珠和琼脂糖珠(Sepharose 4B)。 目前应用最多的是Sepharose 4B，Sepharose是由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖结合成的链状多糖。 Sepharose 4B的特点 符合理想基质的五点要求 Sepharose极易用溴化氰活化 并易于引入不同的基团，在温和的条件下可连接较多的配体 容易吸附大分子物质，吸附量较大 Sepharose4B的结构比Sepharose 6B的结构疏松，机械强度比Sepharose2B好, 所以是亲和层析中广泛使用的基质。 (二) 配体的选择 配体的选择需要谨慎。 选择的配