中国对虾感染白症病毒(wssv)后血细胞差异表达蛋白质的鉴定及其特性分析.pdfVIP

中国对虾SUMO 和UBC9 进行基因克隆，结果显示，中国对虾SUMO cDNA 全 长1128 bp，包含一个282 bp 的开放阅读框（ORF ），编码93 个氨基酸，其理论 分子量为10.6 kDa；UBC9 cDNA 全长 1170 bp，包含一个483 bp 的ORF，编码 160 个氨基酸，其理论分子量为18.4 kDa; 同源性比对发现，中国对虾的SUMO 和UBC9 均高度保守。随后，利用实时荧光定量PCR 分别检测了SUMO 和UBC9 mRNA 的组织分布情况和在WSSV 感染后的表达变化情况，结果显示，SUMO 和UBC9 基因在健康中国对虾各组织中均有表达，但表达水平不同，二者均在血 细胞和性腺中呈高丰度表达；WSSV 感染后，对虾血细胞和性腺中这2 种基因均 呈显著性上调表达，且血细胞中的上调表达更为显著。 （3 ）中国对虾SUMO ORF 和UBC9 ORF 的原核表达及多克隆抗体制备及 应用。利用大肠杆菌系统成功地构建了中国对虾SUMO ORF 和UBC9 ORF 的重 组表达质粒，pET-28a-SUMO 和pET-28a-UBC9 ，诱导表达后得到分子量分别为 19.7 kDa 和25.6 kDa 的重组蛋白，并对目的蛋白进行了纯化；用纯化蛋白免疫小 鼠，分别获得了抗SUMO 和UBC9 的多克隆抗体（PAb ）。应用PAb 分析中国对 虾血细胞中SUMO 和UBC9 的特性，western blotting 结果显示，SUMO 的PAb 可以特异性识别血细胞中13.5 kDa 的蛋白，而UBC9 的Pab 可以识别18.7 kDa 的蛋白；间接免疫荧光实验结果表明，SUMO 分布于血细胞的细胞核和细胞质 中，而UBC9 主要分布于细胞核中。 （4 ）RNA 干扰实验分析 SUMO 和UBC9 在病毒感染中的作用。利用体外 转录法，分别合成了SUMO 和UBC9 的双链RNA（dsRNA ），dsSUMO 和dsUBC9 。 随后，将dsRNA 注射到对虾体内以研究SUMO 或UBC9 基因沉默对WSSV 感 染的影响。结果显示，病毒感染后，RNA 干扰组对虾血细胞中的WSSV 拷贝数 和病毒基因的表达量均较阳性对照组低；累计死亡率曲线显示，SUMO 或UBC9 的沉默均在一定程度上降低了WSSV 感染引起的对虾的死亡。 （5 ）中国对虾蛋白磷酸酶1 催化亚基 β （PP1β ）的基因克隆及原核表达。 首先，采用RACE 技术对中国对虾PP1β 进行基因克隆和生物信息学分析，结果 显示，PP1β cDNA 全长1214 bp，包含一个987 bp 的ORF，编码328 个氨基酸， 其理论分子量为37.6 kDa；同源性比对发现，中国对虾的PP1β 氨基酸序列表现 出高度保守性。随后，利用实时荧光定量PCR 检测了PP1β mRNA 的组织分布 万方数据 情况和在WSSV 感染后的表达变化情况，结果显示，PP1β 在健康中国对虾各组 织中均有表达，但表达水平不同，其中在性腺中表达最高，血细胞次之；WSSV 感染后，对虾血细胞和性腺中PP1β 基因均呈上调表达，并在12 h 达到峰值，且 血细胞中的上调表达更为显著。此外，利用大肠杆菌系统成功地构建了中国对虾 PP1β ORF 的重组质粒pET-28a-PP1β，诱导表达后得到分子量为41 kDa 的重组蛋 白，并对目的蛋白进行了纯化。 关键词：中国对虾；蛋白质组学；WSSV ；血细胞；类泛素化；蛋白磷酸酶 万方数据 Identification and characterization of differentially expressed proteins in Fenneropenaeus chinensis hemocytes upon white