脂肪干细胞复合心包膜修复兔腹壁缺损的实验研究.pdf

2 脂肪干细胞复合牛心包膜修复兔腹壁缺损的实验研究 中文摘要 脂肪干细胞复合牛心包膜修复兔腹壁缺损的实验研究 中文摘要 【背景和目的】 近年来，组织工程技术在女性盆底重建外科学的研究中得到了越来越多的应用， 是女性盆底重建外科学的一个重要的发展领域。本论文针对目前盆底重建手术面临的一些 侵蚀（erosion ）、性交痛(dyspareunia) 、暴露(exposure) 、收缩(shrinkage) 、瘘管（fistula ） 等术后并发症问题，构建一种脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs ）复合脱细 胞牛心包膜（acellular bovine pericardium，ABP ）的新型网片，并将其用于修复兔腹壁缺 损模型，探索组织工程技术在女性盆底重建中的应用，为女性盆底重建的研究提供新思路。 【方法】 1、兔ADSCs 的分离培养、鉴定及标记： （1）使用酶消化法、差速贴壁法取兔腹股沟区脂肪组织体外分离培养兔脂肪干细胞，每 日在显微镜下观察记录其增殖特征及形态特点； （2 ）流式细胞仪鉴定第3 代脂肪干细胞的表面标记物并分别行成脂、成骨诱导分化，证 明其多向分化能力； （3 ）取第3 代脂肪干细胞，以慢病毒介导的绿色荧光蛋白（pGC FU-EGFP-Lentivirus ） 转染，转染后48 小时倒置荧光显微镜观察EGFP 的表达情况； （4 ） 取经pGC FU-EGFP-Lentivirus 标记的第5 代脂肪干细胞，利用流式细胞技术检测 pGC FU-EGFP-Lentivirus 的转染率。 2、交联ABP 的制备：交联ABP 由上海欣吉特生物科技有限公司提供。行HE 染色观察 其脱细胞效果及组织结构。 3、组织工程生物活性补片的构建： （1）将经pGC FU-EGFP-Lentivirus 标记的第5 代兔ADSCs 接种于脱细胞牛心包膜上， I 中文摘要 脂肪干细胞复合牛心包膜修复兔腹壁缺损的实验研究 荧光显微镜观察细胞的生长情况； （2 ） MTT 法检测脂肪干细胞在脱细胞牛心包膜上的增殖情况。 4、兔腹壁缺损模型的建立及补片性能的评估： （1）于12 只成年雌性新西兰大白兔腹壁制作腹壁缺损模型，根据不同的处理方式分为以 下4 组：实验组（将复合兔ADSCs 的交联ABP 植入兔腹壁缺损处）；交联ABP 植入+干 细胞注射组（将交联ABP 植入兔腹壁缺损处后ABP 下注射干细胞）；交联ABP 植入组（单 纯交联ABP 植入）；空白对照组（腹壁缺损处不作任何处理）； （2 ）分别于移植后第1、2 、3 月取出移植物行组织学观察评价宿主的炎症反应及兔ADSCs 复合交联ABP 的生物相容性；行荧光显微镜观察兔腹壁缺损处绿色荧光蛋白的表达情况； 行拉力试验研究生物活性补片植入后的生物力学性能。 【结果】 1、传代培养的兔 ADSCs 形态较为均匀，呈旋涡状、辐射状排列，体外增殖稳定快速。 流式细胞仪检测示CD29、CD90、CD105 表达阳性， CD34 表达阴性，油红O 及茜素红 染色均为阳性。 2 、HE 染色显示牛心包膜的细胞基本脱去，呈由染成红色的胶原纤维组成网格状结构。 3、pGC FU-EGFP-Lentiviru 转染兔ADSCs48 小时后，荧光显微镜可观察到EGFP 高表达。 流式细胞仪检测示pGC FU-EGFP-Lentivirus 的转染率达78%左右。此外，荧光显微镜观 察示ADSCs 在ABP 上黏附生长良好，MTT 示细胞增殖能力与未接种于脱细胞牛心包膜 的ADSCs 无明显区别。 4 、所有动物均未发生补片侵蚀。实验组和交联 ABP+干细胞注射组移植后各个时间点的 移植物皱缩及粘连均显著小于单纯交联ABP 植入组。荧光显微镜观察示植入后的各个时 间点实验组和交联ABP+干细胞注射组均可观察到EGFP 表达，EGFP 的表达量未见明显 差别，且随着时间的推移 EGFP 的表达量均未见明显减弱。组织