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第八章 非线性色谱原理及其在蛋白质分离与纯化中的应用 广州大学生命科学学院 柯德森 基本概念 Cs=KCm 线性色谱:流动相中的样品浓度(Cm)与固定相中的样品浓度(Cs)呈线性关系. 非线性色谱:Cm与Cs不存在线性关系的色谱. 分析色谱大多属于线性色谱;制备色谱大多属于非线性色谱 非线性色谱的特点 样品的保留值可变:非线性色谱的保留值随样品及其浓度的不同而变化; 峰形的不对称性:不是高斯正态分布的; 色谱峰的峰高与浓度不是线性关系:峰高增加的速率随浓度的增加而下降. 基本理论基础 研究对象:样品在固定相和流动相中的浓度处于非线性关系下,各种实验参数对色谱分离过程的影响,建立起柱参数、溶质性质及操作条件之间的定量关系。 首先要了解Cs与Cm之间的函数关系，也即要研究吸附等温线及相应的吸附模型 吸附:处在界面上的分子或原子与其内部分子或原子具有不同的能量与性质,产生了一种不平衡的倾向,造成界面的分子或原子与内部不同,这种差异就形成了吸附现象. 吸附等温线：指在一定温度下物质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系。 分类：凸形、凹形、S形、H形、阶梯形 ？问题：各种类型等温线代表的溶质在两相间的哪些分配特性？ ？问题：从吸附等温线能提供哪些非线性色谱性质的信息？ ？吸附等温线的测定：静态与动态法两大类。 吸附等温线可以提供以下信息： 预测代表该吸附等温线的组分在非线性色谱中色谱峰的形状； 为非线性色谱分离与纯化物质选择最佳条件； 反映被分离物质分子与固定相表面的作用，从而研究分子的构型及吸附状态。 建立分子结构-吸附之间的定量关系，从而由分子结构预测吸附性能。 静态测量法：q与C之间的关系 q=ΔC.V/G 优点：方便简单，不需要特殊的仪器 缺点：测量缓慢，平衡时间长，平衡点不容易判断，数据不易测准，对比较昂贵的生物样品不合适。 动态法常用的有4种方法: 前沿分析法(FA) 特征点前沿分析(FACP) 特征点洗脱(ECP) 平台洗脱(EP) 非线性色谱基本理论 吸附平衡热力学: 吸附平衡动力学; 色谱基本特料平衡方程 非线性色谱固定相 非线性色谱中粗和细的颗粒都在使用，原则上细颗粒填料的柱效高，价格比较贵。粗颗粒填料柱效低，但价格便宜，而且柱压低适合制备柱。 从材料看目前有：硅胶类和有机树脂类。 孔径大小：对不同生物大分子分离有各自不同的合适孔径大小 色谱柱及填充技术 最长柱长，原因： 超过-------无法得到均匀填充床； 柱效不是与柱长永远成比例增长； 高压泵的容量的限制。 色谱柱及填充技术 填充方式： 干法： 湿法： 样品溶解与进样技术 增加溶质的溶解度： 溶剂的性质必须适应于所用的固定相； 样品溶解与进样技术 进样：必须保证大量样品溶液能均匀分布在柱的截面上，使轴向扩散及局部超载降至最低 非线性色谱的3种展开方式 超载洗脱：与传统的洗脱方法差别不大。但样品在固定相上的负载超过了线性洗脱色谱的容量，展开时浓度逐渐稀释，形成较宽而平坦的峰。 优点：产率高，省时，节省溶剂 缺点：柱效不如线性洗脱高，溶剂不断稀释，后期纯化麻烦。 非线性色谱的3种展开方式 前沿分析：样品溶液不是作为一部分进入色谱柱，而是连续不断地输入色谱柱，洗脱展开峰是以一个个台阶的方式展示的。 非线性色谱的3种展开方式 置换展开：与洗脱展开相似，但流动相为与固定相作用力极强的物质组成，去替代结合的固定相表面的溶质分子。 优点：溶质浓度不降低，还可以起浓缩作用。 缺点：置换剂不好找；合适的固定相和流动相的取得不容易。 色谱系统的生物相容性 色谱仪器所用材料对要分离物质的影响； * * 请以上面吸附平衡的简化公式分析: 各种条件下色谱峰形出现的原因 在用溶剂平衡时，先使材料沉淀，用倾泻法除去悬浮的细颗粒，否则由于细颗粒的堵塞，溶剂的流速将显著降低。 适合浓缩痕量组分; 适合产品精制,除去痕量组分; 不会被稀释 *