第二章 分离与纯培养.ppt

基本微生物实验技术 油镜的使用 无菌操作 菌涂片的制作和染色技术 培养基的配制 灭菌和消毒的技术 微生物分离、接种和培养技术 微生物计数法 细菌的接种与培养无菌操作 细菌检验的操作需在无菌室或超净工作台内进行。 无菌室、超净工作台使用前后需进行消毒。 细菌检验使用的物品使用前后需严格灭菌 标本的采集无菌操作 无菌试管、烧瓶的使用 1.无菌（asepsis）：不存在任何活菌。 2.无菌操作：防止细菌进入人体或其他物品的操作技术。 3.清洁：能减少微生物附着在无机物体表面的数量的方法。 4.净化：能显著减少或破坏一定空间中微生物数量和生物活性的方法。 细菌分离、接种法 平板划线接种法： ★目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。 ★方法： ★ 分区划线法：适用于含菌量较多的标本 ★ 连续划线法：适用于含菌量较少的标本 液体培养基接种法 穿刺接种法 :用于观察细菌动力 斜面接种法 ：用于菌种保藏 倾注培养法: 用于细菌计数 分区划线法 连续划线法 亨盖特滚管技术 (Hungate roll-tube technique) 1950年美国著名微生物学家R．E．Hungate因分离瘤胃微生物和产甲烷菌等严格厌氧菌的需要而设计。 4.稀释摇管法 用于分离厌氧菌 将盛有融化的无菌无氧琼脂培养基试管放置于50℃左右的恒温水浴中，用1ml无菌注射器分别吸取10-5、10-6、10-7三个稀释度的稀释液各0.1ml于融化了的琼脂培养基试管中，而后将其平放于盛有冰块的盘中或特制的滚管机上迅速滚动，这样带菌的融化培养基在试管内壁立即凝固成一薄层。每个稀释度重复3次，而后置于37℃（酸奶样品42℃）恒温培养箱中培养。一般培养24-48h后，即可在厌氧管的琼脂层内或表面长出肉眼可见的菌落。 H-10菌株滚管培养后的菌落特征图 亨盖特滚管技术 亨盖特滚管技术 用高纯氮驱除小环境中的空气，使培养基的配置，分装、灭菌和贮存，以及菌种的接种、培养、观察、分离、移种和保藏等过程始终处于高度无氧条件下，从而保证了这类严格厌氧菌的存活。 5. 液体石蜡隔离法 主要用于分离厌氧菌和兼性好氧菌 琼脂培养基 适用于较大的细菌、原生动物和藻类等的分离纯化 样品稀释 纯培养 分离 镜检 （二）用液体培养基分离和纯培养 液体纯培养法 * 第三节 微生物的分离 与纯培养 用途：分离微生物；鉴定微生物种类；微生物细胞计数；菌种保藏；微生物生长；积累代谢产物； 第三节 微生物的分离和纯培养 培养物：在微生物学中，在认为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体。 纯培养物：只有一种微生物的培养物。 海洋酵母菌、鱼病原菌的分离、病原菌纯化 纯培养物——单一种菌 病原菌 例 分离、转接及培养纯培养物时,防止其他微生物 污染的技术。 菌落Colony 高压蒸气灭菌 高温干热灭菌 棉塞 超净工作台、无菌室等 保持无菌的方法 一、微生物无菌技术 无菌工作台 无菌室 无菌接种箱 （超净工作台） 例 几个概念 1. 微生物培养常用器具的灭菌 高压蒸汽灭菌锅 电热烘箱 灭菌接种环 沾取标本 接种 灭菌接种环 杀灭接种环上的细菌，以免污染标本 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境 2.无菌接种操作 分离或接种的基本程序 接种针（环）的灭菌 微生物无菌操作示意图 先將接種環以火焰滅菌法稍至赤紅以滅菌完全將接種環冷卻? 取平板上單一菌落將試管口以火焰滅菌法過火滅菌後，單手將試管管口打開 將含有單一菌落的接種環小心的塗抹在試管中斜面培養基上畫出的斜面如斜面底部常有液體堆積於底部，所以小心不要劃到底部含水處 将无菌琼脂培养基 倒入无菌培养皿内 微生物无菌操作示意图 例 平板划线分离操作 （一）固体培养基分离纯培养 平板，即培养平板琼脂培养基的简称。 指无菌琼脂培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。 二、微生物分离技术 1. 稀释倒平板法 待分离菌的样品（1g或1ml) 无菌水倍比稀释 （1:10,1:100,1:1000 ……) 分别取不同浓度的样品稀释液 混合融化的培养基 （约50℃） 摇匀冷却成平板 恒温箱培养至出现菌落 （操作见下页图片） 稀释倒平板法 流程 （一）固体培养基分离纯培养 缺点： 容易造成某些热敏菌的死亡以及影响一些严格好氧微生物的生长。 1. 稀释倒平板法 稀释 （冷却至约45-50℃） 无菌 取样 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml