高效液相色谱5.ppt

高效液相色谱技术与应用 （五）样品的制备 引言 样品的类型 样品基质分 有机基质 无机基质 物理状态 固体 半固体（乳膏剂、胶剂、混悬剂、胶体剂） 液体 气体 固体与半固体样品的预处理 降低样品颗粒粒度 均质好，取样的代表性好，精密性与准确度较高 表面积大，溶解迅速，易于提取 降低样品颗粒粒度的方法 混合、砍斩、破碎、切割、碾碎、均化、浸渍、研磨、绞碎、压榨、粉磨、过筛 固体与半固体样品的预处理 干燥样品 干燥样品至恒重对分析结果的可靠性十分必要。 过滤 过滤：滤纸、滤膜、功能膜、SPE萃取管、SPE滤片 离心 沉淀 液体样品的预处理 一般方法 固相萃取 液－液萃取 稀释 蒸发 蒸馏 微渗析 冷冻干燥 液－液萃取Liquid-Liquid Extraction, LLE 液－液萃取 液－液萃取常见问题 发生乳化 在水相中加盐 加热或冷却萃取溶器 用玻璃棉塞过滤 两相分离滤纸过滤 加少量不同的有机溶剂 离心 被测物牢固地吸附于微粒上 改变pH 增加离子强度 用极性更强的有机溶剂 被测物与大分子量的化合物结合（如药物与蛋白质） 加入表面活性剂 加有机溶剂、离液序列高的试剂或强酸 加水稀释 以结合更强的竞争试剂替代 两相彼此互溶 使用饱和液 固相萃取Solid-Phase Extract, SPE 优点： 萃取被测物更彻底 分离被测物与干扰物的效率更高 降低有机溶剂消耗 易于收集全部被测物 手工操作更方便 能除去微粒 易于自动化 缺点： SPE萃取管的易变性 有些被测物会不可逆地吸附于SPE管上 重现性差 SPE的应用 除去干扰物和色谱柱“杀手” 浓缩或痕量富集被测物 除盐 更换溶剂 现场衍生化 样品储存与运输 SPE装置 萃取管 圆盘滤头 涂布纤维 SPE仪器 SPE方法建立 润湿活化填料 除去因萃取管暴露于实验室环境时可能聚集的杂质，净化固定相 用溶剂润湿吸附剂，建立一个合适的固定相环境 甲醇为常用的活化溶剂，可用于RP－SPE或极性键合相填料如氰基、氨基和二醇基的润湿活化 加样 冲洗填料（除去干扰物质） 回收被测物 膜分离（Membrane Separations） 膜通常由合成的有机聚合物（如PTFE，尼龙或聚氯乙烯）、纤维素或玻璃纤维制作而成 滤膜在样品制备方面的主要应用为滤过和萃取 滤膜的形状有多种：板、卷、片、囊、筒、螺旋缠绕和空心丝等。 膜技术要点 取出被测物以保持浓度梯度 改变被测物的化学形态（如不带电变为带电形态） 能够利用被测物回收率100% 微渗析 微渗析进样是渗析的一种专用技术。这种方法使用一端有膜的熔融硅胶管小探针。 探针可置入活体组织中（如鼠大脑），有机小分子能够扩散通过膜，用微注射泵将样品抽入环形进样器，进行HPLC在线检测，且不影响受试动物或植物的正常生长。 插入活体组织中的小型微渗探针，所研究的被测物样品是用其它样品预处理方法所做不到的。多娄情况下，不需进一步处理样品，渗析液能直接注入HPLC色谱柱。 固体样品的预处理 索氏提取法（Soxhlet Extraction） 新型萃取方法 超临界液体萃取法（SFE） 　超临界流体具有气体质量传递的性质和液体溶解度的性质，且有比液态溶剂高得多的　溶剂萃取效率和速度，SFE已被广泛用于提取固体基质中的非极性和中等极性被测物。 新型萃取方法 微波辅助溶剂萃取法（Microwave –Assistant Solvent Extraction） 吸收微波的溶剂提取 　微波辐射将溶剂加热至沸点温度以上，该热溶剂在适度压力下，能快速提取被测物。 不吸收微波的溶剂提取 　溶剂不会变热，通常含有水分或其它高介电组分的样品吸收微波辐射，将加热的被测物释放入周围的溶剂中，所选溶剂应能良好地溶解被测物。 新型萃取方法 加速溶剂提取法（Accelarated Solvent EXtraction） 提取容器可在常规烘箱中加热，而不用微波微波辐射。 柱切换 色谱柱切换：初始色谱柱（1柱）的一部分色谱图被有选择地转送至第二支色谱柱（2柱），再次分离的方法。柱切换用于： 在2柱之前除去可能损坏色谱柱的物质 在2柱之前除去强保留杂质 除去在2柱中会覆盖被测物谱峰的干扰物 梯度洗脱的一种替代方法 痕量富集 柱切换 在HPLC中，通过一只高压切换阀使1柱与2柱相连进行CS操作。 样品在1柱上被部分分离，含有被测物的部分被引入2柱，进行最终分离 CS可以做到LC、GC、TLC、SFC、和CE联用作业 衍生化 衍生化方法使被测物与相应的试剂之间发生化学反应，以改变被测物的化学和物理性质。HPLC中的衍生化有四种主要用途： 改善被测物的检测 改变被测物的分子结构或极性，以利于色谱分析 改变基质，以利于色谱分析 改善被测物的不稳定性 衍生化 选择衍生试剂时总的考虑： 衍生试剂必须稳定