反应停对人卵巢细胞株3ao和skov3增殖抑制的研究.pdfVIP

中文 摘 要 反应停对人卯撰癌细胞株3AO和SKOV3 增班抑制的研究 摘 要 目的:卵巢癌是妇科最常见的恶性肿瘤，严重威胁妇女 健康。由于缺乏有效的早期诊断方法，70%的卵巢癌患者被 发现时己是晚期，卵巢癌也是死亡率最高的妇科恶性肿瘤， 其主要的死亡原因在于复发和对包括顺铂在内的化疗药耐 药，在现有的治疗手段下，5年存活率一直徘徊在28%-35-0/o, 远期生存率不超过15%^30%。因此寻找新的更有效的药物， 以进一步提高卵巢癌患者的生存时间和生活质量是非常必 要的。反应停化学名酞咪呱淀酮，是由德国药品制造商20 世纪50年代开发上市的一种镇静剂，曾在欧洲被广泛用于 失眠症和妊娠反应的治疗。由于反应停较强的致畸作用，所 引起“反应停”事件，导致数千名海“豹式”婴儿的诞生此药因 此而声名狼藉。然而对反应停的研究并未终止，70年代以来， 有关反应停临床新用的研究报告不断呈现，近年来由动物及 体外和体内实验发现其具有一定的对肿瘤细胞增殖抑制的 作用，并在多种实体肿瘤(恶性黑色素瘤、结肠癌、神经胶质 细胞瘤等)的临床试验中表现出明显的抗肿瘤作用，故反应停 的抗肿瘤活性有望为临床提供一种新的靶向治疗药物。本实 验用反应停作用于体外培养的人卵巢癌细胞株 3AO和 SKOV3，观察反应停对卵巢癌细胞增殖生长的影响，初步探 讨反应停的作用效果为卵巢癌的治疗提供新的思路。 方法::1反应停溶液的配制 反应停用二甲基亚矾溶解初 中文 摘 要 浓度为102M,4℃保存。临用前37℃恒温搅拌至少30min, 以含 10%小牛血清 RPM11640培养基分别稀释至 10-1- 10-7M，保存反应停最多不超过7天。2细胞培养将处于对 数生长期的卵巢癌细胞株3AO和SKOV3按照相应的浓度加 入%孔培养板于5%CO2.97%湿度，37℃的培养箱中培养 24小时后，设置空白对照组、DMSO对照组、高、中、低浓 度组，每组加入等量培养液、含DMSO培养液 (该溶液中 DMSO浓度和高浓度组反应停溶液中DMSO浓度相同)和 不同浓度的反应停溶液。分别培养24,48,72小时。3细 胞增殖抑制实验 采用MTT 法检测细胞增殖抑制情况。4形 态学观察 倒置显微镜、Giemsa染色和透射电镜从形态学上 观察细胞情况。5DNA Ladder测定提取细胞DNA，用 1.5%琼脂糖凝胶电泳进一步检测癌细胞发生的DNA降解。6 流式细胞分析 采用流式细胞仪定量分析经不同浓度反应停 作用的卵巢癌细胞凋亡率及细胞周期变化情况。 结果:1采用MTT 法检测细胞增殖抑制率，描绘生长 柱状图可知经不同浓度反应停处理后的3AO,SKOV3细胞 生长缓慢，明显的生长抑制，并呈作用浓度和时间依赖性。 而空白对照组和DMSO对照组细胞则生长正常。2形态学观 察 倒置相差显微镜观察，对照组细胞生长良好，细胞透明， 密度较大，呈复层性生长，细胞呈梭形，细胞浆内颗粒较少， 细胞核隐约可见。实验组细胞密度明显减小，细胞颗粒较多， 细胞间界限模糊，漂浮细胞数量增加，存活细胞显著减少。 经Giemsa染色后进行光镜观察，可见到细胞形态也出现明 显改变。对照组细胞形态饱满，细胞核染色均匀，核仁清晰 可见;实验组细胞中出现细胞质浓缩，变圆，核仁染色不均， 中文 摘 要 核物质边聚，但未见凋亡小体。提示实验组细胞出现形态学 改变。透射电镜可见到细胞超微结构改变。对照组细胞器无 明显改变，而实验组细胞发生了较典型的细胞坏死形态变化 和超微结构的改变，如包体缩小，细胞表面有少量微绒毛， 胞质内有空泡，线粒体水肿，靖排列紊乱，大部分消失，粗 面内质网扩张，有不同程度的脱颗粒现象。3DNALadder 测定 提取对照组和实验组细胞DNA，经1.5%琼脂糖凝胶电 泳显示实验组细胞DNA出现不规则降解改变，随着作用浓 度升高降解程度加剧。对照组细胞DNA未出现坏死的特征 性改变，进一步证实了反应停能诱导卵巢癌细胞坏死。4细 胞凋亡率变化 流式细胞仪检测表明与对照组相比，不同浓度 和作用时间反应停实验组细胞凋亡率升高不明显(P0.05),而 细胞周期有明显变化,，Gl期细胞增多((P0.05),