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Southern blotting Northern blotting 的技术原理 Western blotting 三种技术的共同之处 电泳 转膜 杂交 信号检测 Southern blotting 1970 年Edward M. Southern在Edinburgh University发明了这一技术体系，后人就将这一技术体系命名为Southern blotting. Southern blotting 可以用来确定在一个DNA混合池中某一特定的基因。例如可以用来确定整个基因组某一特定的基因。 Southern 杂交步骤 提取基因组 DNA 用适当的内切酶酶切 DNA 。 酶切产物跑 agarose 胶电泳 变性及转膜 与标记好的探针杂交 杂交信号的检测 操作过程 Northern blotting 注意事项： 因为RNA容易降解，操作中应戴手套，避免接触离心管内盖。 Northern 杂交信号常较Southern 弱，应注意控制洗脱时间。 Western blotting Western blotting 提取蛋白 蛋白的SDS电泳 转膜 加入一抗进行杂交 加入二抗进行杂交 杂交信号检测 ( 酶 联 抗 体 与 生 色 底 物 的 反 应) Western杂交结果 * 其他 斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip) 探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 这3种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持物上，并均以针对特定核苷酸(Southern Northern)或氨基酸(Western)序列的特异性试剂作为探针检测它。 三种印迹技术的比较 放射自显影照片 目 录 Southern blotting 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的标记； 是否存在特异基因，拷贝数 Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析, 是否表达；丰度 ；大小 Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究,是否表达；丰度 ；大小 Southern、Northern是在研究DNA分子复性变化基础上发展起来的一种技术。具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适宜的温度及离子强度等)可按碱基互补原则退火形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。此杂交过程是高度特异的。 杂交过程中通常将待测核酸片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交。 1. 从组织中提取DNA 2. 用限制性内切酶酶切DNA ３．酶切后的DNA在Argose胶上电泳将不同大小的条带分开，上（大）、下（小） 基因组DNA电泳图 酶切后DNA电泳图 M DraI EcoRI EcoRV HindIII XbaI ４．将胶上的DNA转移到NC膜 重物 吸水纸 尼龙膜 胶 滤纸 转膜液 ５．将已转好的膜从胶上取下，80度烘２小时将DNA固定在膜上（中性转膜时用）．在杂交液中加入P32标记的探针进行杂交 Southern 杂交结果 ６．杂交后洗膜，洗去非特异结合的探针并压磷屏，最后通过Typhoon扫描获得杂交信号 分子杂交实验 ① ② ③ 目 录 注意事项： 胶浓度一般为0.8%。 制胶转膜注意事项： 1. 胶溶液体积不应超过锥形瓶容量的50%。 2. 加热时应不断摇动以防止暴沸，胶应煮 沸至没有颗粒。 3.胶用水冷却到约60℃再倒胶。 4. 确保酶切完全。 5. 转膜时注意膜和胶之间不能有气泡。 电泳室注意事项： 1. EB 具致癌作用，操作时应戴手套 ; 仪器除电泳槽外不戴手套操作。 2. EB处理： 加水稀释到0.5mg/ml以下；加1倍体积0.5M的KMnO4混匀后再加1倍体积的2.5M HCl混匀，室温数小时；加1倍体积2.5M NaoH混匀即可。 杂交注意事项： 杂交液应完全盖过膜。标记好的探针不要直接加在膜上。 同位素操作注意事项(略) 1970s, E.M. Southern发明了Southern杂交技术被称Southern杂交，而后来发现的用来检测特异RNA分子的技术由于其相似的原理而被称为Northern 杂交。除分析的样品是RNA外其原理和Southern