BRSV研究进展讲解.pptVIP

* BRSV的检测方法的研究进展 报告人：李艳婷 BRSV概述 流行病学 临床症状 血清学诊断 中和试验 酶联免疫吸附试验 直接免疫荧光抗体试验 病原学检测细胞分离培养 聚合酶链反应 牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)是引起犊牛呼吸道疾病的主要病原之一。1970年BRSV首次从患有呼吸道疾病的牛体中分离到。其危害性在于BRSV感染发病率很高，达到60%～80%，死亡率在一些爆发中也能达到20%以上。近年来，我国分别从美国、日本、加拿大、澳大利亚等BRSV感染的高发国引进各种高产牛，但BRSV并没有被列入检疫范围，因此在我国及时开展对BRSV的研究具有重要意义。 BRSV概述 生物学特性 通过电子显微镜观察, BRSV 粒子具有多态性, 多呈球形,直径35 ~150nm, 完整病毒可见有7~15nm 厚的核衣壳,呈螺旋对称,上有7~19nm 的尖棒状纤突,?? 基因组为单分子单链负股RNA，分子量约为5.9×106 Da，直径约4 ~5nm，大小为15~16kb。基因组RNA 是转录和复制的模板, 病毒的10 个mRNA被转录为11 个蛋白，其中G、F、SH、22K 蛋白是病毒囊膜的主要成分，N、P 、L 蛋白是核衣壳的主要成分，M 蛋白位于囊膜和核衣壳之间，不含血凝素，也不含神经氨酸酶。?? 病毒的理化特性 BRSV在CsCI中的浮密度约为1.223g/cm3,对热敏感，56℃水浴30min可以彻底灭活，对酸也敏感，最适宜保存在pH为7.5的溶液中，对脂类溶剂较为敏感。BRSV无粘附性及凝集性，在-80℃可保存数月仍保持感染力。在无蛋白质的溶液中，4℃或室温放置2-4h，其感染力可降至10%或几乎无感染力。 临床症状 病牛表现为精神沉郁、体温升高、干咳、呼吸道有浆液性鼻液或伴有湿性咳嗽。潜伏期大约３ｄ～５ｄ，急性型突然发热、呼吸困难、呼吸频率加快、张口呼吸。肺泡呈间质性肺炎变化，可能伴有肺水肿和肺气肿，背部区肺泡壁破裂。剖检可见肺脏坚实，肺泡膈叶肿大，有纤维蛋白渗出。乳牛在感染ＢＲＳＶ后表现为泌乳量减少或停乳，妊娠母牛感染ＢＲＳＶ后会引起流产。 BRSV的诊断 细胞分离培养 聚合酶链反应 中和试验 酶联免疫吸附试验 直接免疫荧光抗体试验 微滴ＲＴ－ＰＣＲ 细胞分离培养鉴定是最直观的病毒鉴定方法。将待检病料接种细胞后传代培养，第一代一般不出现细胞病变效应（ＣＰＥ），随着传代次数增加，出现ＣＰＥ时间缩短，病变初期出现细胞融合，晚期聚集、圆缩，形成合胞体，细胞液可见轮廓明显嗜酸性包涵体。 细胞分离培养 聚合酶链反应 聚合酶链反应（PCR）通过扩增病毒基因片段来检测病毒，是近年来 快速发展和应用的病原学检测方法，PCR以它特异性强、敏感性高、高效快速的特点已经成为实验室诊断最常用的方法。Vilcek M等建立了BRSV 套式PCR检测方法，这种方法大大提高了检测的敏感性，Boxus M等建立了RT-PCR方法检测BRSV，引物及探针设计来自于BRSV核蛋白保守区序列，具有很好的重复性和特异性，敏感性能够达到传统PCR方法的100倍。Thonur L等开发了RT-PCR一步多重实时定量检测方法，该方法可以快速的同时检测牛呼吸道合胞体病毒、牛疱疹病毒１型和牛副流感病毒３型３种主要牛呼吸道病毒。阳性检出率高达９７％，敏感性与单一PCR基本一致。这种方法凭借它快速、高特异性、敏感性以及节约成本等特点，将在牛呼吸道病毒检测中得到广泛应用。 血清学诊断 中和试验 以待检血清和标准毒进行中和试验，将待检血清用稀释液进行２倍递增稀释之后加入等量标准病毒液（200TCLD50/0.1ML）充分混合。37℃感作1ｈ后将混合液接种在铺满单层Vero细胞的96孔培养板，置于37℃、体积分数为５％的co2培养箱培养，48ｈ后开始观察，14ｄ判定最终结果。中和抗体效价２倍以上为阳性血清。中和试验是传统的病毒诊断方法，但诊断时间较长，对人工免疫后动物无法诊断。 　酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）作为一项血清学诊断技术，已在动 物疫病诊断工作中已经得到了广泛应用。由于酶的 高效催化作用使其对抗原抗体结合识别起到了放大 作用，从而达到了快速、灵敏、高效的检测要求，是重 要的疫病早期诊断方法。Ｒｈｏｄｅｓ　Ｍ　Ｂ等开发了阻 断ＥＬＩＳＡ检测ＢＲＳＶ的方法，采用辣根过氧化氢酶 标记抗体，抗原抗体特异结合后洗涤，滴加底物溶液， 通过测定底物吸光值确定抗原抗体含量。相比于传 统中和滴定试验，这种方法能够更早期的检测到血清 中的抗体，而且其特异性明显优于其他ＥＬＩＳＡ方法。 在我国，王红等建立了以ＢＲＳＶ重组Ｎ蛋白为包被抗 原的的间接ＥＬＩＳＡ检测方法，并且进一步证明这种 方法的符合率、敏感