PCR技术(七)概述.ppt

 Polymerase Chain Reaction The History of PCRs invention PCR的最早设想 Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。 其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适的条件模板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。 1993年获Noble prize Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段。 其缺点是：①Klenow酶不耐高温， 90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。 此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。 此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。 Outline Theory of PCR and Primer design PCR-based methods for detecting variation Troubleshooting for PCR Theory of PCR and Primer design PCR基本原理和影响因素 一、PCR基本原理 PCR是一种快速和简便的DNA体外扩增技术。在模板DNA，引物和4种脱氧核糖核苷三磷酸存在的条件下，利用耐热DNA聚合酶进行聚合反应，经变性、退火及延伸三步骤多次循环，对特定DNA模板进行扩增。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。 GC的合理含量 NCBI验证引物序列是否正确 先打开Blast页面　 /BLAST/ 第一步: 点击“Nucleotide”这边的“Search for short, nearly exact matches” 第二步: 等页面全部出来以后，将上游引物序列或下游引物序列的互补序列输入或粘贴入“Search”框 可选择你有搜索的物种或不作任何选择” 。 然后点击“BLAST！”。 第三步: 新页面完全出来以后，点击“Format! ，会弹出一个新页面，慢慢等待结果全部出来。 第四步: 从Blast结果中你就可以看到你的引物序列和哪些基因的某段匹配及其匹配程度了。  引物设计软件 Gene Runner 3.0 Oligo 4.0 引物分析软件 Primer premier 5 练习 请扩增人类TGF-beta启动子区的基因序列。 答案 从pubmed中寻找人类TGF-beta启动子区的基因序列。 用引物软件设计引物 用blast结果验证引物的可靠性 送公司合成相关引物 常规PCR 标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 　 10ul　 4种dNTP混合物 　 各 200umol/L　 引物 　　　　 　 各10～100pmol　　 模板DNA 　　　 　 0.1～2ug　　 Taq DNA聚合酶 　 2.5u　　 Mg2+　　　　　　 1.5mmol