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质 粒 DNA 制 备plasmid extraction 质粒简介 质粒(plasmid)是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子 其大小范围从lkb至200kb以上不等。 已经在形形色色的细菌类群中发现质粒. 这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复 制和遗传的辅助性遗传单位。 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术． 质粒特性 1. 分子相对小 2. 含有高效的自主复制成分 3. 不相容性(incompatibility) 4. 转移性 5. 选择的标记(selective markers) 6. 限制性内切酶单一切口 质粒的结构特点 分子量相对较小 共价闭合分子 双链环状结构 表达载体 载体含有tac启动子、Lac操纵基因、SD序列、Lac I阻遏蛋白基因等 质粒DNA的提取和纯化  质粒DNA的提取和纯化  一、细菌的培养 (bacterial culture) l?? 先分离单个菌落，接种到含少量适当抗生素的培养基中扩增，随着细菌的生长，质粒DNA也在自主复制。 对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程度上不受到宿主细胞的控制，故在细菌对数生长后期，加入氯霉素（chloromycetin）抑制宿主蛋白质的合成和染色体DNA的复制。质粒DNA的复制不受影响而大量扩增 l?? 所以使用氯霉素的主要目的，是在不减低质粒产量的前提下，减少细菌的培养体积和细菌的数量． ?? 有时质粒在细菌中的扩增状况很差，常是由于质粒携带外源基因或质粒分子量过大所致。 二、细菌的收集(bacterial collection) 细胞生长过程中，排出大量代谢产物，为了提高质粒DNA的纯度，离心弃上清，细菌沉淀最好用STE或生理盐水悬浮，漂洗l-2次，离心管壁上的液体也应该仔细去除干净。 三、细菌裂解 细胞的裂解方法很多，如去污剂法，沸水热裂法、碱变性法，有机溶剂法和溶菌酶法等。不同方法各有利弊，一般要根据质粒性质、宿主菌的特性及后继的纯化方法等多种因素综合后加以选择。 ? 质粒提取的方法 碱裂解法 (Alkaline ) 煮沸裂解法 SDS裂解法 其他 质粒DNA提取方法的选择  l?? 常用的煮沸法，碱法,SDS法均可获得较满意效果．至于有人采用碱法提取小量细菌培养物的质粒， 用煮沸法或SDS法进行质粒DNA的大量分离，只是各个实验室的习惯问题. l选择哪种方法制备质粒DNA，应考虑以下因素： 1．菌株类型（type） 2．质粒的大小(size) 3．细菌染色体DNA变性条件强弱的控制 (denaturation condition) 大质粒（15kb）的处理方法： 采用温和处理方法，使用蔗糖、溶菌酶、EDTA，后再使用SDS裂解，使plasmid损伤减少 小质粒（15kb）的处理方法： 无需特殊处理，碱裂解方法等均可使用 四、细菌的裂解和质粒DNA的提取(bacterial and plasmid extraction) 在NaOH存在的强碱性（pH12.0～12.6）条件下，用SDS破坏细胞壁和裂解细胞，并使细胞的蛋白质与DNA发生变性，释放出质粒DNA 细胞被裂解后，细胞壁、膜的碎片、变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物 当pH调至中性，质粒DNA重新恢复天然的超螺旋 在高盐条件下沉淀，经离心分离，质粒DNA保留在上清液中 1在pHl2.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环(CC)质粒DNA仍为自然状态。 ? B 将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而CC质粒DNA仍然为可溶状态。 ? C、通过离心，可去除大部分细胞碎片染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 碱裂解法提取质粒的试剂及主要成分:(main regeants and components) Solution I: Tris-HCl; EDTA; glucose Solution II: NaOH; SDS Solution III: CH3COOH 碱裂解提取质粒可能存在的问题 少量纯化质粒是，多少菌液比较合适？ 2ml细菌可获得10~15μg质粒 加入Solution II 后溶液应该澄清，如出现浑浊可能存在的情况？ 菌体量过大 菌液与Solution I混合不充分 在热或碱的