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初探药证对应的机制药理学论文 类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，RA)是一种慢性自身免疫性疾病，存在多基因、多通路、多途径的分子功能网络相互作用的复杂病理过程［1-2］。RA属于中医的“痹证”范畴，其证候多样，但寒、热证候属性特征最为明显，在临床辨证论治中的价值也最大［3］。辨证施治、“药-证对应”是中医的基本治则，虽然已有大量RA中医治疗的临床和实验报道，但RA“药-证对应”的分子机制尚不清楚。随着基因组学、蛋白组学、系统生物学的发展，网络药理学(NetworkPharmacology)应运而生，它在网络生物学与多向药理学的基础上提出的药物设计的新思想［4-5］。研究中药多靶点的药理作用机制及复杂疾病网络，最有可能揭示辨证施治的分子基础。本研究基于网络药理学，应用文本挖掘和生物信息学技术，以RA热证为切入点，通过构建、分析RA热证的分子生物网络以及对证中药的药物靶标网络，寻找RA热证“药-证对应”的靶标网络和生物学通路，初步探索RA热证“药-证对应”的分子生物学基础。 1方法 1．1基于RA热证的对证中药定向文本挖掘文本挖掘分为文本数据收集、处理、结构化分析、可视化以及评价5个步骤［6］。首先，登录中国生物医学文献数据库，检索关键词“类风湿关节炎OR类风湿性关节炎”。文献14435篇(检索日期:2011年9月15日)。将收集来的数据，以ANSI编码格式保存。利用文本提取工具，对下载的非结构化的TXT文本数据进行信息提取，保存成格式化的、便于数据库(Access)和大型数据库(MicrosoftSQLServer，SQL)处理的格式。通过关键词对构造算法［7］进行数据清洗工作。然后结合专业知识进行解析，继续按关键词对构造算法进行噪音清洗，直到噪音降到满意为止。然后，结合中医证候要素特点进行定向文本挖掘，在RA数据集内，按照“热”为关键词对文献的主题词进行检索，将数据集定义为“热”子集。然后，针对这个数据子集，分别执行后续的计算［7］。经过计算，可以得到中医治疗RA热证要素的中药用药规律。用可视化软件Cytoscape2．8．2进行可视化处理，并以网络图的形式展现出来。 1．2PubChem数据库搜索药物靶蛋白将定向文本挖掘出的对证治疗RA热证的中药分别输入PubChem数据库［8］检索，找到每种有效成分的人类活性靶蛋白。 1．3基因芯片分析典型RA热证与正常人外周血CD4+T细胞差异基因中日友好医院门诊病人中，随机选取符合纳入标准的早期RA女性患者，RA证候问卷表采集患者各项证候信息，参照相应标准进行寒、热证候判断，筛选出符合纳入标准的RA女性热证患者12名。同时按照排除标准选取中国中医科学院12名健康志愿者(年龄在18岁至70岁之间)作为对照组。采集RA热证患者及健康人空腹静脉血，分离纯化得到CD4+T淋巴细胞，用于基因表达谱芯片分析。比较RA热证与正常人差异基因，选取1．4倍以上的上调及下调的差异基因分析，具体分析步骤见本课题组前期研究报道［9］。 1．4分别构建RA热证对证中药靶标网络及RA热证生物学网络并进行对应分析利用IPA(IngenuityPathwayAnalysis)生物分析软件，在线提交定向文本挖掘出的基于RA热证对证药物的靶蛋白列表及RA热证与正常人差异基因列表。分别构建基于RA热证对证中药靶标蛋白的相互作用网络以及基于RA热证与正常人比较差异基因的相互作用网络。利用软件中的Network、CanonicalPathway、Functions及Comparison等功能模块进行分析，获得药物靶标网络功能及重要生物学通路。同时，比较药物靶标网络和RA热证分子网络，寻找和分析二者的生物学通路的异同。 2结果 2．1RA热证定向文本挖掘结果通过定向文本挖掘，筛选出治疗RA热证的4个常用中药:黄柏、知母、苍术及牛膝，将其作为研究的对象，见图1。 2．2RA热证对证中药靶蛋白及靶标网络通过检索PubChem数据库，分别找到RA热证的对证中药:黄柏、知母、苍术及牛膝4味中药共有靶蛋白123个(略)。通过IPA软件将这些靶蛋白构建RA热证的对证中药靶蛋白的相互作用网络，见图2A所示。经IPA分析，该网络排名前5位的生物学功能见表1。 2．3RA热证与正常人差异基因生物学网络及功能RA热证与正常人CD4+T淋巴细胞的差异基因中，上调基因15个，下调基因6个，详见本课题组前期研究报道［9］。基于上述差异基因和IPA构建的蛋白质相互作用网络见图2B。经IPA分析，该网络主要生物学功能见表2。 2．4RA热证差异基因及其对证中药靶蛋白的共同生物学通路在IPA系统的Comparison功能中，比较RA热证差异基因及其对证