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川芎嗪对内皮祖细胞功能临床护理论文 内皮祖细胞（EPCs）的概念提出已有10年，目前普遍认为EPCs的表面标记为CD3 4、CD13 3、KDR，能进一步分化为成熟血管内皮细胞参与血管新生的干/祖细胞。川芎嗪（TMP）是从活血化瘀中药川芎的根茎中提取的有效成分,对脐静脉内皮具有促增殖和内皮损伤保护作用［1］，并能抑制内皮细胞增殖及新生血管形成［2］，已应用到部分临床心、脑血管等疾病的治疗并取得较好的疗效［3］。而TMP对EPCs功能影响和损伤及保护作用，尚未见报道。本实验旨在观察TMP对体外培养正常和损伤EPCs的功能影响。 1材料和方法 1.1材料6％羟乙基淀粉购自Sigma公司，纤维连接蛋白购自Roche公司，VEGF购自PeprotechEC公司，PECD34购自Caltaglaboratories,FITC－VEcadherin购自Bendersystem公司，PEVEGF2及FITCAC133购自R＆DSystem,胎牛血清、购自GIBCO公司，DilacLDL购自Molecularprobe公司，FITCUEA、TMP购自Sigma公司，CCK8细胞计数试剂盒购自日本株式会社同仁化学研究所，matrigel购自BDbiosciences公司。 1.2方法 1.2.1人脐血培养EPCs脐血采集于温州医学院附属第一医院产科分娩室（已获得知情同意）。培养参考文献［4］，取健康孕妇分娩后脐血50ml,以密度梯度离心法分离脐血中单个核细胞,以5×107cells度接种于包被有纤维连接蛋白的25cm2培养瓶中,每皿加入5ml包含有20%胎牛血清、VEGF（10μg·L-1）,青霉素（105U/L）及链霉素（105U/L）的M199培养液,置37、5%CO 2、饱和湿度培养箱中培养。3d后,洗去未贴壁细胞,添加培养液继续培养,以后每隔3d换培养液。 1.2.2EPCs鉴定在培养第3天时形成细胞集落；在培养的第7天细胞以0.25%胰酶消化后,制成109·L-1的单细胞悬液,加入荧光标记的抗CD3 4、VECadherin、VEGFR2及CD133单克隆抗体各10μl（1g·L-1）,流式细胞仪分析其表达情况；将DiIacLDL以2.4mg·L-1的终浓度加入培养液共孵育3h,2％的多聚甲醛固定10min,再加入3ulFITCUEA,（避光操作），37孵育1h，荧光显微镜下观察，以不加DiIacLDL和FITCUEA的同批培养细胞为对照，阴性对照采用SGC7901；将matrigel试剂、96孔培养板以及枪头于4冰箱过夜，在冰上操作，取50ulmatrigel试剂每孔，于37孵育半小时成胶待用，0.25%胰酶消化后制成细胞悬液接种于铺好成血管试剂的96孔板，培养48h在倒置显微镜下观察管腔形成 1.2.3分组培养第7天的各组细胞以0.25%胰酶消化后,制成细胞悬液计数，分为正常对照组、TMP（5mg/L、25mg/L、100mg/L、200mg/L）干预组、H2O2（500umol/L）氧化应激模型组［6］、TMP（5mg/L、25mg/L、100mg/L）预处理6h后和H2O2共同干预组，共培养24h后进行增殖、粘附功能及细胞凋亡的检测。 1.2.4增殖能力测定制成细胞悬液计数，将等数量EPCs接种到96孔培养板随机分为各组,每组6孔,培养48h后,弃培养液加入100μl新鲜含3％胎牛血清M199培养液，每孔10μLcck8，37培养2.5h后,置酶标仪于波长450nm处测吸光度值（A）。 1.2.5粘附能力测定制成细胞悬液,以为1×104/cm2的接种密度接种到24孔板,分为各组每组3孔,培养48h后,各组细胞以0.25%胰酶消化制成细胞悬液，以相同细胞数接种96孔板每组6孔,置37培养箱中培养30min,洗去未贴壁细胞,倒置显微镜下随机选取10个视野（×400）计数粘附细胞数。 1.2.6细胞凋亡检测在培养的第7天之后，以0.25%胰酶消化下来制成细胞悬液,以5×105cells接种6孔板，0.25%胰酶（不含EDTA）将各孔细胞消化,PBS洗两次成细胞悬液,收集1×105cells离心，加入500μlBindingBuffer重悬浮细胞，加入2μlAnnexinVFITC混匀后，加入5μlPropidiumIodide（PI）染料，混匀、避光、室温反应10min，流式细胞仪上机检测细胞凋亡情况。Annexinv单阳性为早期凋亡细胞，以正常组早期凋亡率为100％,计算各组与正常组早期凋亡率之比。 1.2.7统计分析所有结果以x±s表示,输入SPSS13.0软件包，采用单因