第二章基因工程工具酶解析.ppt

从此，相关研究展开。目前已纯化出3000种限制性内切酶中，其中有30%是在NEB发现的 。 概念: 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ） 一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3,5-磷酸二酯键。 平齐末端 注意 限制性内切酶对外源DNA的作用无种属特一性：对不同的外援DNA,只要有酶的识别顺序即可切割DNA产生相同的粘末端或平截末端，据此可进行DNA的重组。 在A情况下产生的重组体只能被一种酶消化，减少了可逆反应，提高了重组率。转化后还可以用可消化的那种酶(MobⅠ)进行酶切鉴定。 在B情况下，产生重组体。不能再被两种酶识别，消除了可逆反应，效率更高。但转化后不能再用这两种酶鉴定。通常选A的情况。 4. 不具有甲基化功能 II型限制性核酸内切酶的甲基化修饰作用由相应的甲基化酶承担。 5. 对单链DNA的切割 切割效率较低。 （3）DNA甲基化程度 甲基化程度高不被大多数限制性内切酶切割，解决办法是： 选用无甲基化酶的突变菌株； 使用对甲基化酶碱基无切割能力的酶（对哺乳动物DNA）。 DNA 连接酶连接的作用机制 DNA连接酶的催化反应 DNA ligase + NAD+/ATP ↓ 酶-AMP复合物 ↓+DNA AMP-DNA ↓ 相邻3’-OH对活化的磷原子发生亲核攻击 ↓→AMP 3’,5’-磷酸二酯键 是双链－因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。 OH P × × 是相邻的－因此不能封闭gap，只能封闭nick. （六）T4 DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案 1．连接反应一般在灭菌的0.2-0.5ml离心管中进行。 2．10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1～5∶1），补足ddH2O 至8μl。 3．轻轻混匀，稍加离心，56℃水浴5min后，迅速转入冰浴。 4．加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位， 用ddH2O 补至10μl，稍加离心，在适当温度（一般14-16℃）连接8-14hr。 Klenow片段的主要用途（利用5’ →3’ 的聚合酶活性） ⑴修补限制性酶消化DNA形成的3′隐蔽末端 ⑵标记DNA片段的末端 底物用［α－32P］－dNTPs ⑶cDNA克隆中第二链cDNA的合成 ⑷DNA序列的测定 其主要用途有： ⑴　在cDNA合成过程中，切开cDNA的发夹末端； ⑵　载体构建过程中，切去DNA片段的单链尾巴， 形成平末端结构。 （三）DNA连接酶作用的特点 A. 连接的两条链必须分别具有自由3’-OH和5’-P，而且这两个基团彼此相邻； B. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程。 E.coli DNA连接酶 －连接具互补碱基黏性末端(最初研究表明），现在研究可连接平末端；需NAD+辅助因子，活性低，不常用。 T4DNA连接酶－连接具互补碱基黏性末端和平末端， 需ATP辅助因子，活性高，常用。 gap NO Nick OK （四）T4 DNA连接酶连接反应的条件 连接酶反应体系 10×Buffer 1μL 1/2μL 1/2μL vector 50ng 3-30fmol 15-60fmol Insert fragment 100ng 9-90fmol 45-180fmol Ligase 0.5μL 0.5/1μL 0.5/1μL Add ddH2O to total 10μL 10/20μL 10/20μL 反应温度 4℃/16℃ 4-8℃/RT 15-20℃ 反应时间