03第三章 吸附层析.pptVIP

层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。 展层剂使分离物在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附和再解吸附的连续过程，就能导致分离物达到分离目的。 所以这种层析与其他层析一样，选择适当的溶液作流动相是层析获得满意结果的重要因素之一。 二、应用实例 用DNS—氨基酸的聚酰胺薄膜层析鉴定肽N末端 每条肽链(除环状链外)都有游离的N末端氨基酸，它可与荧光试剂DNS-Cl(二甲氨基萘磺酰氯)结合成DNS-氨基酸复合物。 (1)DNS-Cl的性质 DNS-Cl是一种荧光物质，能溶于有机溶剂，在pH9.5～10.5时，它能与氨基酸的一级胺、二级胺、巯基、咪唑基和酚羟基缩合成具有黄绿色荧光的衍生物。DNS-氨基酸衍生物比较稳定。 另外，DNS-Cl也能与氨和氢氧根分别生成显黄色荧光的DNS-NH2和显蓝色荧光的DNS-OH。 （2）展层 样品制备 将DNS-Cl与样品氨基酸混合。 展层 双向展层。 用DNS-氨基酸的聚酰胺薄膜(10cmXl0cm)层析，获得一个分离效果较好的双向层析图谱(见图3-19)，仅需3h。 在紫外分析仪中观察可见图谱。 四、洗脱剂 在吸附层析中用的洗脱剂是液体。 通常它也是溶解被吸附样品和平衡固定相的溶剂。 合适的洗脱剂应符合下列条件： ①纯度较高； ②稳定性好； ③能较完全洗脱下所分离的成分； ④黏度小； ⑤易和所需要的成分分开。 洗脱剂的选择： 根据分离物中各成分的极性、溶解度和吸附剂的活性来选择。 一般蛋白质或核酸被极性强的羟基磷灰石吸附后，要用含有盐梯度的缓冲液洗脱。 而甾体或色素等化合物被极性较弱的硅胶吸附后，则可用有机溶剂洗脱。 所用洗脱剂的梯度浓度大小和极性强弱的选择，需通过试验确定。 五、层析柱的制备与层析操作 柱层析的设备主要有： 层析柱 部分收集器 磁力搅拌器 恒流泵 检测仪 详见图3-4 1．层析柱 绝多数层析柱是下端为细口并带有筛板的玻管。 柱的直径与长度之比，一般为1：10～1：40。 采用极细颗粒吸附剂装柱时，宜用比例大的层析柱。 反之，则宜用比例小的层析柱。 这样有利于节省时间和提高分辨率。 2．吸附剂的用量 根据其自身的操作容量和分离物中各成分的性质决定的。 当操作容量高时，吸附剂用量少。 一般吸附剂的用量为被分离样品的30--50倍。 若样品中各成分的性质相似难以分开时，则吸附剂用量应增大，有时大于100倍。 3．装柱 装柱前要先将层析柱垂直固定在支架上。 装柱后，层析柱中基质应符合如下标准： 填装均匀、松紧一致、没有气泡 装柱的方法分干装法和湿装法两种： 干装法系直接加吸附剂到柱中，然后倒人溶剂，此法不易将气泡排尽。 而湿装法系先加适量溶剂到柱内，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾人柱中(见图3-5)，待其自然沉降至柱高的1／4—1／3时打开柱下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液徐徐下降至需要的高度。 吸附剂表面要平整，应使其一直浸没在溶剂中，严防气泡产生。后一种装柱法对各种基质都适用。 装好的层析柱应立即与洗脱剂连接，在约50cm高的操作压下(见第五章)，控制其流速，让2-3倍柱体积的洗脱剂流过固定相，使其达到平衡，也使固定相高度恒定或离子强度与洗脱剂一致。 4．上样和洗脱 当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻地把分离样品的溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。 待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂(其体积用液面距固定相表面的高度约5cm计)，并在柱上端与装有洗脱剂的贮液瓶连接开始洗脱(见图3-6)。 同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集(按体积或时间分管收集)。 随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定 5.绘制出洗脱曲线 根据测定结果，即可绘制出洗脱曲线 (以管号或洗脱体积为横坐标，以每管溶液中样品的浓度或活性为纵坐标)。 理想的洗脱曲线如图3-7所示。 图中的A峰和B峰均呈对称形，二者没有重叠，这表明样品液中的组分已完全分开。 层析峰的面积(EFG)、峰高(BE)和半峰高的宽度(HI)等参数是定性、定量洗脱物的依据。 6．吸附剂的再生 用过的吸附剂，经适当方法处理后，又恢复其性能的过程称吸附剂的再生。 一般不同吸附剂(或基质)的再生方法是不同的。详细操作参阅各章