第六章分子生物学研究方法——基因功能研究技术解析.pptVIP

* 生科院 * 用取代型（a）或插入型（b）载体进行完全基因敲除实验 * 生科院 * 正负筛选法（PNS法）筛选已发生同源重组的细胞 2. 高等动物基因敲除技术 技术路线主要包括构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法 把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发 生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。 显微注射命中率较高，技术难度相对大些。 电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便。 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。 * 生科院 * * * 生科院 第二节 基因敲除技术 * 生科院 * 模式动物小鼠中完全基因敲除的主要技术策略与应用 3. 植物基因敲除技术 T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广泛的基因敲除手段。 利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将带有报告基因的DNA序列整合到基因组DNA上，如果这段DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基因的表达，从而使该基因“失 活”。 * 生科院 * * * 生科院 第二节 基因敲除技术 * 生科院 * 植物基因敲除及突变体筛选 a.引物设计。LP和RP分别代表插入基因两端的引物，LB是指载体上的一段 引物，目的基因片段(设为900bp)。旁邻序列是经测序后获得的DNA序列。 b.