基因工程第六章资料.ppt

作业：P156 1、2、3、4、5 3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确 （1）DNA定向插入 （2）起始密码 尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。 ATGGAATTC 载体 ATGCGGAATTCT 插入片断 EcoRI EcoRI ATGGAATTC T 重组 但移码突变！ 4. 防止载体自身环化连接 （1）提高插入片断的用量 连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。 （2）用碱性磷酸酶处理载体 载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。 5’ 3’ 载体 插入片断 1. 载体自身环化连接（能存活） 2. 载体之间互相连接（能存活） 3. 插入片段互相连接（不能存活） 4. 一个载体与几个插入片段重组（能存活） 五、载体和外源DNA插入片段的连接结果 5. 几个载体与一个插入片段重组（能存活） 1. 目的 增加受体菌细胞膜的通透性。 第二节 重组体导入细菌细胞 一、感受态大肠杆菌的制备 使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。 2. 菌种 用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。 3. 制备原理 4. 制备过程 培养大肠杆菌 OD600至0.3-0.4 On ice 5-10 min 4℃离心收集菌 用冰冷的60mMCaCl2重悬 4℃离心收集菌 4℃离心收集菌 分装、-70 ℃冻存 用冰冷的60mMCaCl2重悬 On ice 30 min 用冰冷的60mMCaCl2重悬 二、重组DNA导入大肠杆菌 （1）转化（transformation) 大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。 （2）转染（transfection) 大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。 1. 外源DNA导入细菌的几种方法 （3）转导（transduction) 借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。 每?gDNA转化成功的细菌克隆数。 3. 转化方法 2. 转化率 简单，但转化效率不高（106-108/?gDNA）。 （1）热休克法（heat shock） 转化效率高（高于109/?gDNA）。 （2）电转化法 10ng载体DNA 100?L感受态菌 On ice混合，静置10分钟 42oC 1分钟 加入1mL LB培养基 37℃摇1小时 10-100?L转化液涂含抗菌素的平板 吸附DNA 摄入DNA （1）热休克法 LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6 冰浴15分钟，2°C离心集菌 冰冷的水重悬菌体 2°C离心集菌 冰冷的水重悬菌体 2°C离心收集菌体 少量冰冷的水重悬 分装成 50-300?L 电转仪调为2.5kV,25?F 脉冲控制器200-400? 0.5?g质粒DNA On ice混合 加入1mLSOC培养液 37°C中速震荡60分钟 10-100?L转化液涂含抗菌素的平板 转化 （2）电转化法 4. 平板培养基培养细菌 10-100?L转化液 涂于含抗菌素的平板 37℃过夜 环形重组质粒 质粒自我连接 线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。 ①环形质粒数 （1）重组质粒 5. 影响转化率的因素 ①生长状态 制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。 ②必须在冰冷的条件下制备。 要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。 ④储存感受态菌要在-70℃以下 ③CaCl2处理 ⑤使用感受态菌时必须迅速融化 融化后一般不能再次冻存使用。 （2）感受态细胞 （competent cells) 把重组的噬菌体?DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的?噬菌体颗粒。 6. 体外包装的噬菌体的转导 （1）体外包装（in vitro packaging） （2）转导（transduction） 通过受体菌细胞表面的?DNA接受器位点（receptor site)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。 cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32℃下培养细菌时能够保持溶源性。 但当温度升高到44℃—45℃时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，?DNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。 （3）cI857基因突变的?噬菌体 但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。 cI857 其它基因 溶源状态（?DNA不转录、不翻译） ?DNA 阻遏 蛋白 阻遏 蛋白 44℃—45℃ ?DNA转录、翻译合成外壳蛋白 32℃ ?噬菌体1 外壳蛋白基因E发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。 在cI857基因突变的?噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型?噬菌体。 （4） 互补型噬菌体 外壳蛋白基因D发生了无义突变，不能合成头部的包装识别蛋白，但能合成其