Southern杂交技术概述.ppt

基本内容 一、核酸分子杂交技术 二、Southern杂交的原理 三、Southern杂交的主要步骤 四、Southern杂交的应用 五、课堂小结 六、作业 一、核酸分子杂交技术 核酸分子杂交技术是分子生物学中最常用的基本技术之一。 1、基本原理： 具有一定序列同源性的两条核酸单链在一定的条件下按碱基互补配对原则退火形成双链。此杂交过程是高度特异性的，但杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补。 杂交的双方是待测核酸序列及探针。将核酸从细胞分离纯化后可在体外与探针杂交，也可直接在细胞或组织内进行原位杂交。 一、核酸分子杂交技术 2、核酸分子杂交的分类： ①液相杂交：将探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体。杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难，误差较高。该法很慢、费力且不精确，但它开拓了核酸杂交技术的研究。 一、核酸分子杂交技术 2、核酸分子杂交的分类： ②固相杂交：将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条游离在溶液中。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。固相杂交时，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，膜上的杂交物容易检测和能防止靶DNA自我复性等优点，故该法最为常用。 一、核酸分子杂交技术 2、核酸分子杂交的分类： ③膜杂交：用标记DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素（NC）膜上的DNA序列。Brown等应用这一技术评估了爪蟾rRNA基因的拷贝数。 一、核酸分子杂交技术 2、核酸分子杂交的分类： ④原位杂交：菌落原位杂交；组织原位杂交；染色体原位杂交等。 一、核酸分子杂交技术 2、核酸分子杂交的分类： ⑤生物芯片 ：高通量，高效的最新生物技术。 一、核酸分子杂交技术 一、核酸分子杂交技术 一、核酸分子杂交技术 二、Southern杂交的基本原理 Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定DNA分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）; 二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即核酸分子杂交过程。 二、Southern杂交的基本原理 该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。 早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。近年来印迹方法和固定支持滤膜都有了很大的改进，印迹方法如电转法、真空转移法；滤膜则发展了尼龙膜、化学活化膜（如APT、ABM纤维素膜）等。 二、Southern杂交的基本原理 利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。 三、Southern 杂交的主要步骤 1、待测DNA样品的制备、酶切 2、待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 3、凝胶中DNA的变性：碱变性 4、Southern转膜： 硝酸纤维素膜 (NC) 、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 三、Southern 杂交的主要步骤 三、Southern 杂交的主要步骤 三、Southern 杂交的主要步骤 三、Southern 杂交的主要步骤 5、探针的制备 ①探针的选择原则 高度的特异性 制备探针的难易性 检测手段的灵敏法 三、Southern 杂交的主要步骤 5、探针的制备 ②探针设计原则 长度：10~50bp 碱基成分:G+C含量为40%~60% 探针分子内无互补序列。 避免同一碱基重复出现。 一旦选定某一序列后，尚需与已知的各种基因序列进行同源性比较，与非靶区域的同源性不应超过70%或有连续8个或更多的碱基同源。 三、Southern 杂交的主要步骤 5、探针的制备 ③探针的种类 cDNA 探针、基因组DNA探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。 三、Southern 杂交的主要步骤 5、探针的制备 ④放射性探针标记物 [α-*N]-dNTP 、32p(14d)、35S(87d)、3H(12y)、125I(60d)、14C、131I 特性： 检测特异性强；灵敏度高；对酶促反应无任何影响，也不影响碱基配对的特异性和稳定性；易造成放射性污染；半衰期短的同位素应用受到限制，随用随标记，立即使用，不能长时间存放。 三、Southern 杂交的主要步骤 三、Southern 杂交的主要步骤 5、探针的制备 ⑤非放射性标记 优点：无环境污染，可较长时间贮存 要求：标记物应具有耐热、对组织细胞无特异亲和性、分子量小，对探针杂交无影响或影响甚小，不影响DNA三维空间构象的形成。 三、South