southern印记杂交概述.pptVIP

Southern blot分子杂交 贾宾 王赛 肖炜恩 查强 Southern分子杂交是核酸杂交的一种 根据核酸变性与复性的特性，特定核苷酸序列的单链DNA或RNA能够在一定条件下与具有互补性的核酸链退火形成双链结构，称之为核酸杂交 将已知的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA进行标记，制成核酸探针，就可以用它检测样品中是否存在同源序列，或确定不同物种之间的亲缘关系，已成为分子生物学中一类重要的检测手段 Southern杂交技术（Southern blot）用于检测DNA Southern杂交技术原理 Southern杂交技术是由Edward M. Southern在1975年首先发明的用于检测DNA的一种核酸杂交技术，并因此而得名 根据毛细管作用的原理，将在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用，检测这些被转移的DNA片段。 Southern blot印迹杂交原理示意图 Southern blot技术优点： Southern blot方法十分灵敏，在理想的条件下，用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即便每条电泳带仅含2ng DNA也能被清晰地检测出来。 注意事项： 1. 膜的大小及预杂交、杂交过程中所用试剂的量可根据需要进行适当调整。 2．将凝胶中和至中性时，要测pH，防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维素膜。 3. 要注意赶走凝胶和滤纸及硝酸纤维素膜之间的气泡。 基因组DNA经酶切成小片段（EcoR I或 Hind III） 电泳分开各片段（1％琼脂糖凝胶电泳） 变性（双链经碱变性解开成两条单链） 转膜及固定（DNA经毛细管作用转移到尼龙膜上， 紫外交联固定） 预杂交（减少标记探针的非特异性结合， 小分子鲑精DNA为竞争性封闭剂） 杂交（靶DNA单链与DIG标记的c-myc探针之间以 碱基互补的原则进行杂交） 洗膜（洗去未与靶DNA结合的探针） 检测（杂交条带通过抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色） 实验步骤 1d 1d 1d 实验步骤 两组共用一块凝胶，共7个样 1.基因组DNA10 mg 2.酶切样品（1） 3.酶切样品（2） 4.阳性对照（pSV-c-myc重组质粒经BamH I 酶切后的8.5 kb线性片段，10pg/ml, 10ml) 5.酶切样品（1） 6.酶切样品（2） 7.基因组DNA10 mg 组1 组2 二. 1％琼脂糖电泳 实验步骤 （1） HL60基因组DNA10μg 16 μl 10×Buffer TANGO+ 2 μl EcoR I（10 u / μl） 2 μl 总体积 20 μl 37℃保温1.5h。 （2） HL60基因组DNA10μg 16 μl 10×Buffer R 2 μl Hind III（10 u / μl） 2 μl 总体积 20 μl 一. 基因组DNA的限制性内切酶酶切 实验步骤 将凝胶浸在5倍体积的胶变性液中, 慢慢摇动20分钟。 ddH2O洗2次。 在胶中和液中慢慢摇动15分钟。 三.变性 实验步骤 在搪瓷盘中加入300ml10×SSC，放上培养皿和小玻璃板 四.转移 实验步骤 将3张长滤纸浸湿，逐张放在玻璃板上，用移液管的滚动，赶走气泡 实验步骤 切除多余凝胶，小心地将凝胶放在滤纸上，赶走滤纸与胶之间的气泡 实验步骤 再将与胶大小相同的尼龙膜放在胶上，同样不能有气泡，然后放上三张浸湿的滤纸，赶走气泡 实验步骤 紧贴凝胶四周各放一张X光片 实验步骤 小心蒙上一张比搪瓷盘大的保鲜膜。保鲜膜要紧贴滤纸，但不能让滤纸移动 实验步骤 用刀片在离滤纸周围约1-2 mm处，轻轻割断保鲜膜，但不能割破滤纸。取走滤纸上的保鲜膜 实验步骤 整齐地放上草纸，数张草纸一折二，草纸堆要高出搪瓷盘边约10cm 实验步骤 在草纸上放上玻璃板, 压上约500g重的重物, 转移过夜 实验步骤 将胶和尼龙膜一起翻过来,用铅笔深入加样槽在尼龙膜上画上槽的位置 正面朝上放在紫外交联仪中（909室），交联固定 ddH2O稍加漂洗后空气中自然干燥 五.固定 实验步骤 将尼龙膜放入杂交管内, 加预杂交液, 60℃封闭6小时。 倒出预杂交液,加杂交液,60℃杂交过夜。 回收杂交液 (可重复使用), 将膜放在洗膜溶液I中,室温洗2次,每次摇动5分钟。 再在洗膜溶液II中(60℃预热后直接倒进表面皿),