DNA的电泳检测概述.pptVIP

DNA的琼脂糖凝胶检测 在分光光度计检测的基础上，进一步用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的纯度与浓度，重点检测DNA是否降解，是否含RNA与蛋白质。 实验目的 了解琼脂糖电泳法检测DNA质量与浓度的原理 掌握琼脂糖电泳法检测DNA质量与浓度的方法 学会分辨不同质量DNA的电泳带型 实验原理 电泳是现在用于分离和纯化DNA片段的最常用技术。制备好一块“胶”即一块包含电解质的多孔支持介质，并把它置于静电场中，DNA分子将向阳极移动，这是因为DNA分子沿其双螺旋骨架两侧带有富含负电荷的磷酸根残基。当DNA长度增加时，来自电场的驱动力和来自凝胶的阻力之间的比率就会降低，不同长度的DNA片段就会出现不同的迁移率。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。 琼脂糖浓度 溴化乙锭（EB）是一种吖啶类染料，它在紫外灯照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的DNA。 电泳缓冲液的组成  常用的电泳缓冲液的配制 加样缓冲液 DNA片段长度标记 DNA片段长度标记通常叫作 DNA Marker,本实验使用Bio DL2000 为DNA片段长度标记，分别由100bp、250 bp、500 bp、750 bp、1000 bp、2000 bp、DNA Marker不仅可以作为凝胶中DNA片段长度的一个标记，还可以作为电泳的对照。每次取5ul电泳时，每条带的DNA量为50ng，750bp为100ng。 所需仪器、耗材 电泳仪、电泳槽 微量移液器 凝胶成像系统 天平 各种玻璃器皿（烧杯、容量瓶及广口瓶） 所需试剂 溴化乙锭（EB） 琼脂糖 TBE缓冲液 加样缓冲液 实验方法 2.加样 取一PCR小管，加入5ul DNA样品，再加入3ul电泳上样缓冲液，混匀后加样于凝胶的孔格内。操作时，可用右手持移液器，左手握住右手腕，左肘支撑桌面，防止点样时右手晃动。 同样操作在第一样品孔内加入5ul DNA分子质量标准物。 3.电泳 电泳槽中加入电泳缓冲液，将胶床放入，液面高出胶面1-2mm。 盖上电泳槽盖，接通电源，样品端接负极（DNA向阳极移动），以5V/cm电压电泳。使DNA移入琼脂糖胶内，一般为溴酚蓝迁移2cm左右。 4.观察 取出凝胶，置短波紫外线（254nm）下观察照像。比较样品DNA与DNA标准品的荧光强度，并计算出样品中DNA浓度。观察有无RNA、蛋白质及DNA降解条带。 注意事项 防止紫外线对人皮肤及眼睛的损伤，避免直接照射皮肤与眼睛。 EB是强诱变剂，有致癌性，操作时要带手套，防止污染。所有含有EB的溶液在弃置前应当进行净化处理。 思考题 加样缓冲液的作用是什么？ 琼脂糖中加入EB的作用是什么？ 电泳时，为什么DNA/RNA分子将向阳极移动？ * * 0.1—2 2.0 0.2—3 1.5 0.4—6 1.2 0.5—7 0.9 0.8—10 0.7 1—20 0.6 5—60 0.3 DNA/RNA分子的分离范围（kb） 凝胶中的琼脂糖含量[%（W/V）] 用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kb的DNA/RNA片段。 琼脂糖凝胶 EB染料 5×：54g Tris碱 27.5g硼酸 20mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0) 0.5×0.045moL/L Tris—硼酸 0.001moL/L EDTA Tris—硼酸（TBE） 10×：108g Tris碱 15.5mL 85%磷酸 40mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0) 1×：0.09moL/L Tris—磷酸 0.002moL/L EDTA Tris—磷酸（TPE） 50×：242g Tris碱 57.7mL 冰乙酸 100mL 0.5moL/L EDTA (PH8.0) 1×：0.04moL/L Tris—乙酸 0.001moL/L EDTA Tris—乙酸（TAE） 浓贮存液（每升） 使用液 缓冲液 4℃ 300m moL/L NaoH 6 mmoL/L EDTA 18%聚蔗糖水溶液 0．15%溴甲酚绿 0．25%二甲苯青FF V （碱性加样缓冲液） 4℃ 0.25%溴酚蓝 40%（W/V蔗糖水溶液） IV 4℃ 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 30%甘油水溶液 III 室温