I型超敏反应实验设计概述.pptVIP

* IL-12抗I型超敏反应的实验探究 实验目的 1.验证IL-12对Th2型免疫应答向Th1型转换，下调IgE的作用。 2.探究IL-12的注射剂量对下调IgE的影响。 3.探讨IL-12在治疗I型超敏反应中的前景。 实验原理 IgE的产生依赖于细胞因子IL-4，Th2细胞受变应原刺激活化分泌IL-4等细胞因子,可诱导变应原特异性B细胞增殖、分化成浆细胞，通过调节Ig类别转换等机制产生特异性IgE抗体。 IL-12可刺激NK细胞分泌IFN-γ，并诱导Th0向Th1细胞方向分化，抑制向Th2细胞分化，减少Th2细胞以及其生成的IL-4。同时，IFN-γ还具有抑制B细胞合成IgE的潜在活性。从而可以达到下调IgE的效果。 IFN-γ是Th1的特征性细胞因子，IL-4是Th2的特征性细胞因子。利用酶联免疫吸附法（ELISA)检测致敏大鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-4的表达水平,以及血浆中IgE的水平。即可验证IL-12对Th2型免疫应答向Th1型转换，下调IgE的作用。 IL-12刺激Th2向Th1转化，下调IgE 实验原理 ELISA原理 双抗夹心法 测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。 实验原理 动物：Wistar大鼠12只,体重200～220 g，雄雌各半，随机分5组，即正常组1只、模型组1只、实验组10只。 药物:鼠IL-12 试剂：鸡卵白蛋白, ,抗鼠1gE抗体，抗鼠IL-4抗体，抗鼠IFN-γ抗体，酶标抗体，底物，生理盐水。 仪器:微孔板，酶标分析仪，离心机。 实验材料 实验流程 1、分组 2、变应原的制备与注射 3、外周血采集及IL-4、IFN-γ、IgE的测定 （ELISA） 4、数据分析 1、正常组：1只 未经处理的对鸡卵清蛋白不过敏 的wistar大鼠 2、模型组：1只 经鸡卵清蛋白致敏的wistar大鼠 3、实验组：10只 经鸡卵清蛋白致敏的wistar大鼠 ps：模型组和实验组均是用鸡卵白蛋白与氢氧化铝悬液的混合液致敏和诱发，制成的Ⅰ型超敏反应动物模型。 分组 1、取50 μg鸡卵清蛋白制成5mL 10μg /mL的溶液（溶于生理盐水中） 2、制备800 μg /mL的IL-12，按照下图做倍比稀释（IL-12稀释于鸡卵清蛋白中） 药物的制备 稀释比 1: 100 1: 200 1: 400 1: 800 1: 1600 1: 3200 1: 6400 1: 12800 1: 25600 1: 51200 浓度 ug/ml 16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125 0.0625 0.03125 1、正常组不做处理 2、模型组和实验组于致敏两周后,腹腔内注射药物 （鸡卵清蛋白+IL-12）50μL 药物注射 正常组 模型组和实验组 鸡卵清蛋白 IL-12 50μL 1、用眼眶取血法取外周血，离心取上清液 外周血采集及IL-4、IFN-γ、IgE的测定（ELISA） 2、ELISA 检测血浆中IL-4、IFN-γ和IgE的滴度 1、包被抗体：抗体（抗鼠IgE抗体）用包被液稀释好后100μl/孔加样，37℃孵育1ｈ或者4℃过夜，之后用超纯水洗三遍，在干燥的吸水纸上拍除多余的水分。 2、封闭：加1%的脱脂奶粉，200μl/孔，37℃放置1ｈ或者4℃过夜，之后甩干，不洗，此时的抗体板子可以直接使用。 3、加抗原IgE：每孔加100μl需要检测的IgE于已经封闭好的酶标板，小心吹除气泡，37℃孵育1ｈ或者4℃过夜，之后用PBS洗三遍，在干燥的吸水纸上拍除多余的水分。 4、加酶标抗体：酶标抗体50μl/孔加于酶标板，37℃放置1ｈ，之后用PBS洗三遍，必要时要进行适当的浸泡，在干燥的吸水纸上拍除多余的水分。 5、显色：显色底物加于酶标板，100μl/孔，37℃孵育15min后用1滴的硫酸终止显色反应。 6.重复ELISA实验，检测小鼠血清中IFN-γ和IL-4的浓度变化 7.数据分析，用酶标分析仪读出血清中IgE、IFN-γ和IL-4的效价 ELISA(以IgE为例) 预期结果 正常组：IL-4、IFN-γ和IgE水平很低 模型组：IgE和IL-4效价较正常明显升高， 效价较正常明显降低 实验组： 特定浓度的IL-12对下调IgE效果最明显 IL-4变化趋势与IgE相同,IFN-γ相反 实验讨论 一、 预期外的结果 IL-12浓