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二维电泳技术 轩辕铮铮 200806 蛋白质组学 蛋白质组学：指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。 蛋白质组分析的首要要求 将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析 。 2-DE技术是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术 。 发展简史 1970 年 Kenrick和Margolis发明等电聚焦-梯度凝胶电泳的二维电泳技术 1975年 O’Farrel建立现代高分辨形式的蛋白质二维电泳法 1982 年 Anderson 提出人类蛋白质组作图谱的概念 1986 年 Switzerlan Geneva 大学建立第一个蛋白质序列数据库—SWISS-PROT 1994年 Wilkins 提出蛋白质组 1997 年 Jon Minder发明荧光差异双向电泳（DIGE） 1998 年 完成16种生物或组织的蛋白质组图 二维电泳的原理 第一向：在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦(IEF) 第二向：在第一向垂直方向上进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS) 蛋白样品制备 样品制备的基本原则： 尽可能提高样品溶解度，减少样品蛋白质的损失 解除蛋白质之间以及与其它生物大分子的相互作用，使蛋白质完全处于变性状态和还原状态 减少对蛋白质以及蛋白质组的人为修饰 完全去除样品中的核酸和某些干扰因素 总之：尽可能简化步骤 细胞裂解 样品的溶解 是2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。 溶解的目标： 1、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降）； 2、溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除； 3、溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态。 增加样品溶解性的手段 变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。 表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。 还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或?-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP）进行还原。 起载体作用的两性电解质（ Carrier ampholytes ）：即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。两性电解质的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于0.2％（w/v)。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。 非蛋白物质的去除 核酸、脂、多糖：大分子，可能阻塞凝胶孔径；盐：小分子，浓度过高会降低等电聚焦的电压。 核酸：超声（防止产生泡沫）和核酸酶（产生假点） 脂与多糖：超速离心（部分损失） 盐：透析（时间长），凝胶过滤，沉淀重悬法（部分损失） 避免蛋白水解和降解的措施 保持低温 变性剂：尿素、硫脲 蛋白酶抑制剂：EDTA、PMSF或或混合抑制剂 样品制备实例 1．菌液培养，收集菌体（5000×g，5min ）； 2．使用PBS洗菌体两次（5000×g，5min），悬于3ml裂解buffer（7M urea，2M thiourea，4％CHAPS） 加1mM PMSF； 3．冰水浴超声破碎，400W，5s/14s，40次； 4．加RNase，DNase，16℃处理1h； 5．Bradford法测浓度； 6．-70 ℃冻存。 一维固相pH梯度等电聚焦（IEF with IPG）： IPG胶的材料是Immobilines，为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在pH3~10不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混合物