论茴香霉素对小鼠同种异基因皮肤移植的影响.docVIP

论茴香霉素对小鼠同种异基因皮肤移植的影响 摘要：　目的: 阐明茴香霉素对淋巴细胞反应性的影响以及在皮肤移植中抑制排斥反应的作用。方法: 用MTT法检测茴香霉素刺激下淋巴细胞在单向或双向混合淋巴细胞反应中的反应性。C57BL/6小鼠作为供体, BALB/c小鼠作为受体。手术前3 d分别给3组BALB/c小鼠皮下注射生理盐水、 环胞霉素A以及茴香霉素, 手术当天继续注射至术后第7天。环胞霉素A及茴香霉素的注射剂量分别为: 20 mg/kg、 12.5 mg/kg。结果: 在剂量10.0 μg/L时, 茴香霉素能抑制单向或双向混合淋巴细胞反应中淋巴细胞的反应性（P均0.01）; 茴香霉素组移植皮肤的存活时间明显高于环胞霉素A组以及对照组。结论: 茴香霉素能明显抑制淋巴细胞的反应性; 并且能明显延长受体对皮肤移植物的耐受时间, 可能为移植免疫排斥的治疗提供新的途径。 关键词： 茴香霉素 混合淋巴细胞反应 皮肤移植　　茴香霉素是由链霉菌分泌的一种活性成分, 能结合在核糖体60S亚基上阻止多肽链形成。作为临床药物, 茴香霉素已被用于治疗由真菌和阿米巴原虫引起的疾病[1]。最近有研究发现, 茴香霉素与学习、 记忆关系密切[2-4]。然而茴香霉素在免疫系统方面的相关研究很少, 我们在研究中意外发现茴香霉素能明显抑制淋巴细胞的增殖活化（另文发表）, 因此, 将其试用于动物体内研究。本研究以混合淋巴细胞反应为模型测试茴香霉素处理的淋巴细胞在体外对同种异基因抗原刺激的反应性, 以皮肤移植为模型观察其体内对免疫系统的抑制作用。结果显示, 茴香霉素对单向和双向混合淋巴细胞的反应性均有明显的抑制作用, 并能明显地抑制受体对供体皮肤的排斥反应, 延长移植物的存活时间。提示茴香霉素对免疫系统有着明显的抑制作用, 可能为开发免疫抑制药物提供新的途径。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 SPF级C57BL/6雄性小鼠(6～8周龄, 体质量18～22 g); SPF级BALB/c雄性小鼠(6～8周龄, 体质量18～22 g), 由南方医科大学实验动物中心提供。刀豆蛋白A（ConA）、 碘化丙锭（PI）、 L谷氨酰胺、 β巯基乙醇、 茴香霉素和MTT均购自美国Sigma公司。RPMI1640、 胎牛血清（FBS）为美国GibcoBRL公司产品。质量分数为111 g/L的水合氯醛由广州华侨医院提供, 环胞霉素A由华北制药厂生产, 庆大霉素由华北制药厂生产。6/0羊肠手术缝合线由上海浦东金环医疗用品有限公司提供, 显微外科器械生产于上海医疗器械有限公司手术器械厂, 显微外科手术镜为德国Laica公司产品。 　　1.2 方法 　　1.2.1 淋巴细胞悬液的制备 将BALB/c或C57小鼠断髓处死, 无菌分离双侧腋窝、 锁骨下、 腹股沟浅表淋巴结和肠系膜淋巴结, 去掉被膜, 机械研磨, 于200目不锈钢网筛过滤。收集细胞, 用冷PBS离心（300 g, 5 min）洗涤细胞2次后, 细胞重悬于RPMI1640完全培养液中, 调整细胞密度为2×109/L。 　　1.2.2 同种混合淋巴细胞反应（MLR） （1）双向MLR: 将BALB/c小鼠淋巴细胞悬液种于96孔细胞培养板上, 每孔100 μL, 作为刺激细胞。分别设茴香霉素组、 茴香霉素＋ConA组、 ConA组、 地塞米松＋ConA组、 地塞米松组、 刺激细胞＋反应细胞组（对照组）、 刺激细胞组、 反应细胞组及RPMI1640完全培养液空白组。茴香霉素与地塞米松的终浓度分别为10.0 μg/L和1.0 g/L。在37、 50 mL/L CO2培养箱中孵育48 h后, 加入100 mL C57BL/6小鼠淋巴细胞悬液, 作为反应细胞（密度为2×109/L）, 继续培养72 h后, 加入MTT（终浓度为5.0 mg/L）, 4 h后离心弃上清（300 g, 5 min）, DMSO溶解沉淀后, 酶标仪检测A540值。（2）单向MLR: 细胞培养及分组同上, 在加入反应细胞前先用25 mg/L丝裂霉素作用30 min, PBS离心（300 g, 5 min）, 洗涤细胞3次。 　　1.2.3 皮肤移植供体的准备 C57BL/6小鼠腹腔注射质量分数为111 g/L水合氯醛5 mL/kg麻醉, 俯卧固定, 消毒后约取1.5 cm×1.5 cm的背部皮肤, 刮去皮下的脂肪以及血管等组织, 放于无菌的生理盐水中备用。 　　1.2.4 皮肤移植受体的准备 BALB/c小鼠15只随机分为生理盐水、 环胞霉素A以及茴香霉素3组, 腹腔注射质量分数为111 g/L的水合氯醛0.3 mL/kg麻醉, 俯卧固定。背部消毒后, 取下比供体皮肤稍大一点的皮肤, 并除去覆盖于背上