第三章定点突变与重组蛋白表达分析.ppt

第三章  基因重组 与定点突变 (A) 5 add-on mutagenesis. Primers can be modified at the 5 end to introduce 加到PCR引物5‘端的序列掺入到PCR产物的末端。一个PCR扩增片段可与另一个PCR扩增片段上的序列相重叠，其后的反应中，这段重叠序列可以作为引物被DNA聚合酶所延伸，由此产生一个新的重组分子。 非生产链 生产链 取代突变 缺失突变 插入突变 几点补充： 重叠延伸反应中非生产链的命运？ 重叠延伸反应进行基因剪接，其不同部位在反应中执行不同功能 引导区(priming region):寡核苷酸3’端 重叠区(overlap region):寡核苷酸5’端 插入区：重叠区和引导区之间 盒式突变 （cassette mutagenesis), 又称片段取代法 （DNA fragment replacement) 关键 1.目标基因序列中有适当限制酶切位点 2.如何得到各种合适的用以取代目标基 因中特定DNA片段的突变DNA片段 三. 区域性定向突变 四. 随机突变（random mutagenesis) 当缺乏目的基因序列的详尽资料时，定点突变就受到限制，此时可利用随机突变。 待突变基因克隆到载体上，其下游紧接两个限制酶切位点。 前一酶切位点是5‘突出，后一酶切位点是3’突出 ExoIII催化线性双链DNA或有缺口环状DNA自3‘-OH端逐一释放5’单核甘酸。 适当时机终止酶切反应 缺口填补，类似物掺入DNA链的一处或多处 S1核酸酶处理单链末端，形成平末端 50％基因携带有错配的碱基，导致位点变异 第四节 重组蛋白质的表达 一. 目标蛋白在E.coli中的表达 在 E. coli 中表达蛋白是非常简单, 快速 和便宜 的。有很多商品化和非商品化的载体，在N-末端或C-末端有标签（tag),并有很多菌株供使用者选择。 The expression of proteins in E. coli is the easiest, quickest and cheapest method. There are many commercial and non-commercial expression vectors available with different N- and C-terminal tags and many different strains which are optimized for special applications. 优点 1.遗传学和生理学背景清楚 2.容易培养，特别是高密度发酵 3.外源基因常可以高效表达 不足 1. 不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰 2. 限制二硫键的形成，多亚基复合体的组装 3. 外源基因易形成不溶性的包涵体 表达载体 （expressing vector) 用来在宿主细胞中表达外源基因的载体，除具有克隆载体的性质外，还带有转录和翻译所必需的DNA序列。 原核细胞表达载体，E.coli 真核细胞表达载体，yeast,mammalian cell Recombinant proteins can be produced in E.coli cells using specific expression vectors. Basic elements for making an E.coli expression vector 表达载体的一般特点 复制起始点 选择性基因 强的，可诱导的启动子 强的转录终止序列 核糖体结合位点 合适的多克隆位点 2. 与外源基因有效表达的相关因素 1）有效的转录起始 2）有效地翻译 3）蛋白质水解作用 4）蛋白质的外泌 3. 蛋白质表达的方法 A typical expression experiment consists of the following step: Picking of a single colony from a freshly streaked plate of the expression host containing the recombinant vector. Growing of a starter culture. Inoculate(接种)with the picked colony up to 50 ml of rich medium (such as LB or 2xYT) containing the