第四章PCR技术讲解.ppt

对基因转录产物进行定性与定量的检测，相对传统的检测方法，如Northern杂交、斑点杂交（ RNA dot）等而言，RT—PCR的精确度更高，且样品用量显著减少。利用RT—PCR对难检测的基因进行相应的检测与研究更易获得成功。另外，还能同时分析多个差别基因的转录。如植物方面，RT—PCR常常用于研究环境胁迫对植物基因表达的影响，以及在特定的环境或生长阶段中植物体不同部位基因表达的差异性。 　　对基因转录中剪切与拼接的检测：如果RT—PCR引物确定了mRNA片段，根据其是否包含某个外显子，将产生两种差别DNA片段，进而在凝胶电泳图谱上显示出迁移率不同的条带。因为转座子涉及到特定的DNA序列及转座酶识别位点，用RT—PCR方法可以较精确地研究转座过程的分子机制。 电泳分离不同大小的DNA片断 其原理为PCR反应中采用两种不同浓度的引物，经若干轮循环后，低浓度的引物被消耗尽，以后的循环只产生高浓度引物的延伸产物，结果产生大量单链DNA。 不对称PCR的单链DNA和双链DNA的产量随引物比率的不同而变化。最佳引物比率范围在1：100到1：20之间。反应中模板DNA的量决定获得最多单链DNA和最少双链DNA的循环次数，模板太少则单链DNA产生少，太多则双链DNA水平过量。 随着植物转基因技术的日趋成熟，世界范围内被批准上市的转基因农作物也不断涌现，然而人们对转基因产品的安全性仍有争论，至少他们要求对餐桌上的食物是否由转基因植物加工而成拥有知情权。为此，建立一种能区分转基因植物和天然植物的检测方法十分重要。目前，世界各国批准上市的转基因植物种类繁多，但绝大多数使用花椰菜花斑病毒（CaMV）的35S启动子。请设计一种能快速灵敏地检测转基因植物的实验程序，并简述其机制。 进行不对称PCR有两种方法： （1）PCR反应开始时即采用不同浓度的引物。 （2）进行二次PCR扩增，第一次PCR用等浓度的引物，以期获得较多的目的DNA片段，提高不对称PCR产率，取第一次扩增产物（含双链PCR片段）用单引物进行第二次PCR扩增产生单链DNA。 第一种方法的缺点是只能用限定浓度的引物，大大地降低了PCR产率，此外，当引物缺乏、有游离dNTP存在时，PCR的特异产物和非特异产物会相互引发新链的合成，降低反应的特异性。所以，不对称PCR反应中，dNTP浓度应比标准PCR反应低。 第二种方法由于第一次扩增产生大量的目的DNA，直接将目的DNA片段从琼脂糖凝胶中回收，除去不需要的引物及非特异产物，用单引物进行第二次PCR扩增，此法可提高单链DNA的产率，甚至可达皮摩尔（pmol）。不足之处是二次分离步骤增加PCR污染的几率。 为了克服上述方法的缺点，有人设计同一反应管中的不对称PCR，即设计第3个引物，位于前一对引物内侧，其Tm值比前一对引物Tm值高10℃，前若干轮循环采用低温退火，产生大量双链DNA，后面的循环高温退火，只有第3个引物可与模板结合、延伸，结果产生单链DNA。 不对称PCR由于只有一个引物延伸，其扩增产物不是以指数形式增加，而是线性增加，因此不对称PCR较一般PCR产率低，欲获得大量单链DNA需更多的循环，至少要30-40个循环。 不对称PCR的效率较标准的对称PCR低，这种低效率往往通过增加PCR循环数得到补偿。如果仍得不到足够的单链DNA，可尝试下列改进方法： （1）改变引物比率，从0.5：50 pmol~5：50 pmol范围内试验； （2）最后5个循环内补加2UTaqDNA聚合酶； （3）试验相反的不对称引物比率； （4）再增加5~10个循环。 二、多重 PCR 普通PCR由一对引物扩增只产生一个特异的DNA片段。许多情况下，欲检测的基因十分庞大，可达上千个kb，这些基因常常多处发生突变或缺失。而且这些改变相距数十至数百个kb，超过PCR扩增DNA片段的长度，欲检测整个基因的异常改变，采用一般PCR需分段进行多次扩增，费时费力，采用多重PCR（multiplex PCR）则可克服上述问题。 多重PCR就是首先设计合成位于多个缺失好发区域两侧的引物，每对引物之间核苷酸长度尽量不同，以使扩增后电泳分析时有各自的条带位置，然后将多对引物加入反应体系，进行常规PCR扩增，30-40个循环后，对PCR产物进行电泳检测。如果基因某一区段缺失，则相应的电泳图谱上此区段PCR扩增产物长度变短或片段消失，从而发现基因异常。 DMD是一种常见的致死性X-连锁遗传病。杜氏肌营养不良（Duchene muscular dystrophy，DMD） 多重PCR具有灵敏、快速的特点，特别适用于检测单拷贝基因缺失、重排、插入等异常改变，其结果与Southern杂交结果同样可靠，且