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动物细胞表达制 备 药 用 蛋 白 思 考 要制备出我们想要的蛋白，需要了解些什么，做些什么？ 生产用动物细胞的要求和获得 常用生产用动物细胞的特性 基因工程细胞构建和筛选 生产用动物细胞的要求和获得 （1） 原代细胞 是直接取自动物组织器官,经过消化分离而获得。 用量大，浪费时间。 常用的有：鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞等。 NO.1 （2）二倍体细胞系 　原代细胞经过传代筛选克隆，挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。 二倍体细胞有正常细胞的特点： ①染色体组型是2n核型； ②贴壁依赖接触抑制； ③可传代培养50代； ④无致瘤性。 （3）转化细胞系 常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。 自发 人工诱变 常用生产用动物细胞的特性 W1-38：正常胚肺组织人二倍体细胞系。 核型为2n=46。成纤维细胞，能产生胶原，培养基用BME （Eagle’ Basal medium）。10%小牛血清，pH7.2, 倍增时间为24h，有限寿命50代。 安全，用于制备疫苗。 NO.2 MRC-5：从正常男性肺组织中获得的人二倍体细胞系。 核型为2n=46。 属成纤维细胞。 有限寿命42～46代。增殖速度较W1-38快，对不良环境敏感性较W1-38低。对人的病毒敏感。用于生产疫苗。 BHK-21:从5只无性别的生长1天的地鼠幼鼠肾脏中分离的;成纤维样细胞,核型为2n=44;培养基为DMEM加7%胎牛血清。 用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程细胞构建。 Vero：从正常成年非洲绿猴肾脏分离的。为贴壁依赖的成纤维细胞，核型2n=60；培养基为199培养基，加5%胎牛血清； 用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、狂犬病毒。 基因工程细胞构建和筛选 NO.3 真核细胞基因表达载体的构建 使用的载体有两类： 1） 病毒载体 牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、 杆状病毒 2） 质粒载体 1） 病毒载体 牛痘病毒：用构建多价疫苗 腺病毒、逆转录病毒：用于基因治疗。 杆状病毒：用于外源基因表达。 2）质粒载体 在细菌和哺乳动物细胞体内都能扩增。都含有如下基本成分： ①允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。 ②含有使基因表达的调控元件。 ③能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。 ④有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。 基因载体的导入和高效表达 工程细胞株的筛选 1） 基因载体的导入 基因载体导入动物细胞最常用方法是： 磷酸钙沉淀法 电穿孔法 磷酸钙沉淀法： 溶解的DNA 加Na2HPO4和CaCl2 形成磷酸钙沉淀， DNA被包在磷酸钙沉淀中，形成DNA—磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面接触时，则通过细胞吞噬作用而将DNA导入。 电穿孔法： 借助电穿孔仪的高压脉冲电场， 使细胞膜出现瞬时可逆性小孔， 外源DNA沿小孔进入细胞。转 化率较高，拷贝数低。 真核生物细胞生产药用蛋白优点： ①具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构,理化特性最接近于天然蛋白分子； ②具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化； ③具有重组基因的高效扩增和表达能力； ④具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养，表达水平较高； ⑤CHO（注射用重组人促红素 ）细胞属于成纤维细胞，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的分离。 因此，可以针对性的筛选细胞株 由于CHO-dhfr-细胞自身缺失二氢叶酸还原酶（dhfr），无法自身合成四氢叶酸，所以必须在添加了次黄嘌呤（hypoxanthine）、胸腺嘧啶（Thymidine）和甘氨酸的培养液中才能得以存活。二氢叶酸还原酶能够被叶酸类似物氨甲喋呤(methotrexate ,MTX)所抑制 ,用含有目的基因及与之相连的DHFR基因的重组质粒转化CHO dhfr细胞 ,利用浓度不断提高的 MTX选择抗MTX的细胞系 ,其中 DHFR基因及与之相连的目的基因一起扩增 ,从而使目的基因高水平表达。 主要采用DHFR系统和GS 系统 2）高效表达工程细胞株的筛选 二氢叶酸还原酶系统DHFR DHFR扩增仅仅发生在二个等位基因中的一个。在稳定系中扩增的基因得以保持，因为它们位于染