第四章基因克隆的载体讲解.pptVIP

柯斯质粒载体的特点 具有λ噬菌体的特性； 具有质粒载体的特性； 具有较高容量的克隆能力； 具有与同源性序列的质粒进行重组的能力 柯斯质粒pHC79系由质粒pBR322和噬菌体λ的cos位点的一段DNA构成全长4.3kb 设计构建的柯斯质粒一般长4～6kb。其上的cos位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体λ的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体λ一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制 Digestion Ligation C) Packaging and infect Formation of a cosmid clone λ 取代载体 2. 组装. 连接 3. 侵染 体外包装 λ噬菌体DNA体外重组后，一般必须经过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将重组DNA导入E.coli细胞内。这是因为以感染方式导入细胞的频率可达106~108/μgDNA，而以转染（translation）的方式导入的频率仅为103～105/ μgDNA。 λ噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNA（约48.5 kb）的75%~105%。 由于λ噬菌体包装时，当DNA的长度短于野生型的78%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降。因此只包装它的野生型DNA（48.5KB）的75% ～ 105%左右的ＤＮＡ，要求λ载体DNA和外源DNA长度之和在39～53kb之间。 插入式载体可携带的外源ＤＮＡ片段较替换式为小。 凯伦噬菌体载体 既有插入型；又有替换型 在基因工程实验中的用途十分广泛 承受外源DNA的能力：几个kb到23kb （左右臂连接） （三段自身连接） （插入片段） 根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选 2.3单链DNA噬菌体载体 (M13) M13噬菌体载体  M13是一种含单键（+）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。这类载体主要用来获得大量的单链ＤＮＡ片段，这种单链ＤＮＡ片段在遗传学研究中主要用来测定ＤＮＡ序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。 M13噬菌体的特点 感染Ecoli后，在宿主细胞内会形成双链的复制型DNA（ replication form DNA, RF DNA）。可以象质粒DNA那样在体外进行纯化和操作。 成熟的噬菌体颗粒仅能感染E.coli的F+细胞，这是因为这种噬菌体的感染位点在性散毛上。但是无论是RFDNA或ssDNA都能转染E.coli的F+或F-细胞。 噬菌体颗粒的大小是受其DNA的大小制约的，这一点正好与λ噬菌体相反。所以M13噬菌体并不存在包装限制的问题。 M13单链DNA噬菌体的生命周期 RF DNA Phage M13 replication in the host cell: + RNA pol DNA polIII ± RF Nicked by gene 2 protein + ss-Rolling circle replication, then cut and ligate Coated with gene 5 protein Gene 5 protein is replaced by gene 8 protein ect. Linear M13 phagereleased from the cell. M13载体 具有多克隆位点(MCS)，方便克隆。许多M13载体的多克隆位点与质粒载体pUC序列的多克隆位点是相同的，在克隆位点选择上更为方便。 可以定向的克隆DNA片段，克隆在M13 RFDNA分子上的双链DNA片段，到了子代噬菌体便成了单链的形式。所以如果要同时分离ＤＮＡ分子中的双链，则需要两种独立的克隆。根据M13的生物学特性知道，M13子代噬菌体中总是只含有（＋）链，所以M13载体克隆的外源DNA片段在子代噬菌体中究竟是含有DNA分子中的哪条链，则完全取决于外源DNA克隆时的取向。这样一来，为分别分离外源DNA分子的两条链带来一定的麻烦，解决这一问题的一个行之有效的方法就是定向克隆技术。 Blue-white selection M13载体系列的优点 1. 在这类载体的基因组中有一条饰变的β-半乳糖苷酶基因片段（Hind?片段），其中插入了一段具有密集的多克隆位点的序列； 2. M13载体系列是应用基因工程技术成对地构建的，可有效地克隆双链DNA分子中的每一条链。 M13mp18 MCS