第四章克隆载体讲解.ppt

T7 T3 用于体外转录 六、 人工染色体—克隆大片段DNA 1、真核生物染色体中的关键部位（分裂、复制必需区） 着丝粒(centromere,CEN):分裂 端粒(telomere,TEL)：保护染色体、维持染色体复制 自主复制序列(autonomously replication sequence，ARS)：复制起始位点 2、人工染色体：以真核生物的CEN、TEL、ARS 为骨架，可携带插入的外源基因进行复制，即为人工染色体 3、种类：酵母人工染色体（yeat artificial chromosome,YAC) 细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC) YAC:利用酵母的TEL、ARS及CEN构建的人工染色体 结构：左臂：TEL、选择标记、ARS 、CEN、 右臂：TEL、选择标记 特点：容量大（50-1000kb），减少克隆数 稳定性差，不易分析 BAC：利用细菌复制必需区(TEL, ARS, CEN）构建的人工染色体 载体容量为100-300kb Structure of a bacterial artificial chromosome (BAC), used for cloning large fragments of donor DNA. CMR is a selectable marker for chloramphenicol resistance. oriS, repE, parA, and parB are F genes for replication and regulation of copy number. cosN is the cos site from l phage. HindIII and BamHI are cloning sites at which foreign DNA is inserted. The two promoters are for transcribing the inserted fragment. The NotI sites are used for cutting out the inserted fragment. PAC载体 质粒 λ噬菌体 柯斯质粒 单链噬菌体 克隆DNA大片段 ±* + + - 构建基因组文库 - + + - 构建DNA文库 + - - - 常规的亚克隆化 + - - - 构建新型的DNA结构 + - - - 序列分析 + - - + 单链探针 +** - - + 外源基因在大肠杆菌中的表达 + - - - 四种常用载体的比较 * 外源DNA如超过10kb，则重组质粒的转化率和DNA得率都非常低 　　** 已有个别材料可用于此目的　　　　　　　　　　 小 结 载体的概念、性能 plasmid 质粒载体必须具备的基本条件 pUC质粒载体 pBR322质粒载体 phage λ phage cos ends 主要类型 包装长度 M13vector 质粒发展趋势及关键辅助序列 噬菌粒载体 柯斯质粒载体 特点、结构特征、 人工染色体 * Cloning by cosmids. The cosmid is cut at a BglII site next to the cos site. Donor genomic DNA is cut by using Sau3A, which gives sticky ends compatible with BglII. A tandem array of donor and vector DNA results from mixing. Phage is packaged in vitro by cutting at the cos site. The cosmid with insert recircularizes after it is in the bacterial cell. (From J. D. Watson, M. Gilman, J. Witkowski, and M. Zoller, Recombinant DNA, 2d ed. Copyright ? 1992 by Scientific American Books.) 替换型载体(replacement vector)　　　该类载体经改造后的长度约为40kb，在非必需区域内含有两个相同的酶切口，两者间的距离为14kb长，使用时用酶切开，分离去除这个14kb长的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。 特点：容量大，且有一个下限：40-14kb=26kb，包装下限为36.4kb，因此其载装下限为10.4而上限为