基因工程第二节概述.pptVIP

第二节 PCR产物的克隆 在PCR扩增中得到的产物是可以克隆的，更主要的是可以根据基因或DNA片段的核苷酸顺序来设计引物将其扩增出来并克隆 在设计克隆方法的时候，主要考虑产物如何能与克隆载体高效连接，有以下几种方法： 一、在PCR产物两端添加限制性酶切位点 一、在PCR产物两端添加限制性酶切位点 为了使PCR产物能够方便地装载到克隆载体上，可在扩增过程中在其两端添加限制性酶切位点。 利用特定设计的引物通过扩增来实现，而无需在产物两端连接带酶切位点的接头（linker）。 在PCR扩增中，对于引物来说，只要其3’端的序列有足够的长度来启动延伸反应，而5’端含有不匹配的序列不会影响正常的扩增，在第二轮，特别是几轮扩增后，由于新模板的出现和累积，该5’端不匹配的序列就变成可匹配的序列。 在设计引物时，除了考虑正常的特异性序列外，还可在引物的 5’添加酶切位点的序列以及保护序列，在选择酶切位点的种类时，要保证所选的酶切位点在扩增的DNA片段内部不存在，如果对扩增的DNA片段的序列不清楚，可优先选用切割频率相对较少或酶切位点为8个碱基序列的酶切位点。 如果在扩增cry3Aa基因的启动子序列时，上游引物主要由两部分组成，一部分是用于特异性扩增的20个碱基序列另一部分是BamHI酶切位点（GGATCC）和3个碱基的保护序列。 二、A/T法克隆 使用最广泛，无需在产物末端添加酶切位点，对任何引物扩增的产物都可以克隆。 该方法主要适用于TaqDNA聚合酶扩增的产物。 从图中可以看出，用相同的 引物对同一个模板进行扩增 时，用TaqDNA聚合酶比用 PwoDNA聚合酶扩增的产物多一 个碱基，因此TaqDNA聚合酶扩 增的产物可与T载体进行黏末 端的互不连接，达到高效克 隆的目的。 最常用的T载体有pGEM-T和T Easy。这些载体的特点是，将普通克隆载体切成线状，并使之在3’端含有一个突出的碱基T，pGEM-T是在pGEM-T-5Zf（+）基础上改造而来的，即在其多克隆位点中的EcoR V处将载体切成平末端的线状DNA，再在其3’端添加一个T碱基。 在DNA的3’端添加一个T碱基的方法有很多种，如用末端转移酶和底物ddTMP可以产生单个T的突出末端，有些识别不对称序列的限制性内切酶，如MboII,XcmI,和HphI，在切割DNA后可直接产生一个3’突出的T,用TaqDNA聚合酶和高浓度的ddTTP也可产生3’突出的P。 拓扑异构酶I可以结合在双链DNA的特异位点上，并可在一条链上识别位点5’-CCCTT序列之后打开磷酸二酯键，释放出能量可以催化DNA切口处的3’磷酸基团与拓扑异构酶I的第274位的酪氨酸残基共价结合并切断DNA。同样，这个共价键又会受到切口处的5’羟基的攻击，进行可逆反应，恢复切口处的磷酸二酯键，重新将DNA连接起来。根据这一性质，PCR-TOPO在其3’端突出的T上共价结合了一个拓扑异构酶I，当带3’端突出A的 PCR产物与该T载体 互补配对时，拓扑异构酶I就将该缺口连接起来。 三、平末端DNA片段的克隆 1、pPCR－Script AmpSK（+）克隆载体 该载体从pBluescriptIISK（+）菌粒改造而来，只是将多克隆位点当中的XbaI和SpeI位点改成SrfI位点，（5-GCCC/GGGC-3）克隆DNA片段时，先将载体用SrfI切成线状，再与目的DNA的片段混合作连接反应。在连接体系中除了添加T4DNA连接酶外，还加入SrfI酶。在这个反应体系中，当载体发生自连后SrfI酶又会将其切开，载体就处于酶切与连接的动态平衡中。只有当载体与目的DNA片段连接后，酶化学反应才能稳定下来，从而将总体反应平衡向载体与目的DNA片段连接这个方向倾斜。 2、PCR-Blunt载体 特点：lacZ基因下游融合了一个ccd基因，该基因对大肠杆菌是致死的。3.5kb，含有卡那霉素抗性基因和zerocin抗性基因。 在克隆外源平末端DNA时，先将载体切成线状，再与目的DNA连接，转化大肠杆菌，若发生自连，获得载体的宿主细胞会死亡，只有外源DNA与载体连接后，ccdB基因的表达受到阻断，含有重组质粒的大肠杆菌才能存活。 四、长片段DNA 的PCR扩增 为提高扩增产物的长度，一方面改进缓冲体系 另一方面采用混合DNA聚合酶，即主体使用扩增效率高，延伸能力强的Taq DNA聚合酶，少量使用具有3→5’外切酶活性的高温DNA聚合酶（如Pfu或Pwo DNA 聚合酶），及时切除不匹配碱基的掺入。 如：将Taq DNA聚合酶 和Pwo DNA 聚合酶结合起来的长片段PCR扩增试剂盒，可扩增达40kb的DNA。 * * 到载体上。 二、A/T法克隆 三、平末